基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝課件

單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,單擊此處編輯母版文本樣式,第二級(jí),第三級(jí),第四級(jí),第五級(jí),,,?,?#?,第四講 基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝,,藥用蛋白質(zhì)的合成復(fù)雜，要有精確折疊的空間結(jié)構(gòu)，要有糖基化，才能使藥物發(fā)揮真正的功能細(xì)菌和酵母等產(chǎn)品要么是包涵體，要么難以糖基化功能修飾動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)來(lái)生產(chǎn)有功能的蛋白質(zhì)，大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞特別是人源細(xì)胞的培養(yǎng)在藥物生產(chǎn)中的位置會(huì)越來(lái)越重要人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰質(zhì)炎、乙肝疫苗干擾素、單克隆抗體、重組基因工程產(chǎn)品組織型血纖蛋白溶酶原激活劑、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生長(zhǎng)因子等?,第四講 基因工程動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制藥工藝?,1,第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征,,昆蟲(chóng)系統(tǒng)、哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，最成功、重要表達(dá)活性外源蛋白的有效系統(tǒng)，應(yīng)用于藥物蛋白質(zhì)的表達(dá)一、哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征,1. 動(dòng)物細(xì)胞的特征,細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì),和細(xì)胞核,沒(méi)有細(xì)胞壁亞細(xì)胞器，功能獨(dú)特?,第一節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞制藥的表達(dá)系統(tǒng)與特征?,2,2. 動(dòng)物細(xì)胞代謝,動(dòng)物細(xì)胞的不同代謝途徑及其相應(yīng)的酶體系定位于特定的亞細(xì)胞區(qū)域通過(guò)胞內(nèi)運(yùn)輸（囊泡包裹）實(shí)現(xiàn)區(qū)域之間的物質(zhì)、信息和能量流動(dòng)，通過(guò)穿梭實(shí)現(xiàn)不同代謝途徑之間的交換。

在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作為合成代謝的前體，因此動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)具有一定的靈活性葡萄糖受限可增加谷氨酰胺的消耗得以補(bǔ)償，反之亦然谷氨酰胺是動(dòng)物細(xì)胞的氮源，谷氨酰胺受限時(shí)，可增加其他氨基酸的消耗得以補(bǔ)償?,2. 動(dòng)物細(xì)胞代謝?,3,糖代謝特點(diǎn)：,動(dòng)物細(xì)胞吸收葡萄糖后，進(jìn)行糖酵解，大部分葡萄糖分解為丙酮酸，進(jìn)一步被還原為乳酸，乳酸分泌到胞外并在培養(yǎng)液中積累丙酮酸還可轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶,A,，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，徹底氧化產(chǎn)生,CO,2,和水小部分（,4,％～,8,％）葡萄糖進(jìn)入戊糖磷酸途徑，把葡萄糖轉(zhuǎn)化為,4,、,5,、,7,碳糖和還原力,NADPH,，,5,碳糖用于核酸合成，其他中間產(chǎn)物進(jìn)入脂肪酸代謝、核酸代謝和氨基酸代謝葡萄糖代謝旺盛，會(huì)產(chǎn)生大量的乳酸，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性?,糖代謝特點(diǎn)：?,4,氨基酸代謝特點(diǎn)：,吸收谷氨酰胺后，進(jìn)入氨基酸代謝途徑，通過(guò)脫氨、轉(zhuǎn)氨等作用，合成其他必需和非必需氨基酸大多數(shù)谷氨酰胺在脫氨酶催化下，生成谷氨酸，并釋放氨，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性小部分谷氨酰胺通過(guò)轉(zhuǎn)氨生成其他嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代謝的前體谷氨酸還原酶把谷氨酸轉(zhuǎn)化為中間產(chǎn)物α,-,酮戊二酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞提供能量。

所以谷氨酰胺在細(xì)胞能量代謝中具有重要作用谷氨酰胺與丙酮酸和草酰乙酸發(fā)生轉(zhuǎn)氨作用，生成丙氨酸和天門冬氨酸，丙氨酸可進(jìn)入培養(yǎng)液并積累在快速生長(zhǎng)的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)體系，轉(zhuǎn)氨作用是主要的代謝途徑?,氨基酸代謝特點(diǎn)：?,5,不同的培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸在正常細(xì)胞系中，丙酮酸羧化產(chǎn)生草酰乙酸，而草酰乙酸來(lái)源于谷氨酰胺在連續(xù)細(xì)胞系中，沒(méi)有這種流動(dòng)能量是以,ATP,和,NADPH,的形式提供，來(lái)源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二種細(xì)胞系對(duì)各個(gè)代謝途徑的貢獻(xiàn)和所起的作用不同常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整個(gè)代謝過(guò)程，避免有毒廢物積累?,不同的培養(yǎng)條件，葡萄糖和谷氨酰胺代謝重疊于丙酮酸在正常細(xì)胞,6,3. 蛋白質(zhì)糖基化,蛋白質(zhì)合成是以mRNA為模板，在核糖體上完成而蛋白質(zhì)的糖基化無(wú)需模板指導(dǎo)，因此糖蛋白的寡糖結(jié)構(gòu)容易發(fā)生變化糖蛋白的單糖單元:α-D-葡萄糖、α-D-半乳糖、α-D-甘露糖、α-D-木糖、α-D-巖藻糖、N-乙酰-α-D-葡萄糖胺、N-乙酰-α-D-半乳糖胺和α-N-乙酰神經(jīng)氨酸（或唾液酸）糖基化類型：寡糖基以共價(jià)鍵與蛋白質(zhì)的氮原子結(jié)合為N-糖基化，或與氧原子結(jié)合為O-糖基化這兩種糖基化的位點(diǎn)和數(shù)量及糖的種類都不同。

?,3. 蛋白質(zhì)糖基化?,7,N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序列為Asn-X-Thr/Ser (X為除脯氨酸以外的任意氨基酸)如果X為Trp、Asp、Glu和Leu，對(duì)糖基化有負(fù)影響，而第三位Thr能增強(qiáng)糖基化N-糖基化分為高甘露糖型、復(fù)合型和雜合型三種類型，共同核心是3個(gè)甘露糖和2個(gè)N-乙酰葡萄糖胺組成的5糖（Man,3,GluNAc,2,），其他糖形成支鏈高甘露糖型的支鏈為甘露聚糖（5～9聚體），無(wú)其他糖復(fù)合型含有2個(gè)以上支鏈，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等雜合型至少含有一條復(fù)合糖鏈，另一個(gè)鏈含有甘露糖?,N-糖基化：聚糖部分連接在天門冬酰胺的氨基上，其模體的保守序,8,O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)保守序列O-聚糖有四種不同的核心結(jié)構(gòu)，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化會(huì)影響蛋白質(zhì)的局部構(gòu)象O-糖基化比較小，一般為1～6個(gè)寡聚糖，但比N-糖基化變化更大O-糖基化只在高爾基體上進(jìn)行，糖基單元有木糖、葡萄糖?,O-聚糖連接在Thr/Ser的羥基上，還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)保守序列?,9,糖基化磷脂酰肌醇錨著點(diǎn)：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用，都具有相同的核心結(jié)構(gòu)：膽胺-PO,4,-Man,2,-GlcHN,2,-肌醇-PO,4,-脂。

膽胺形成膜內(nèi)蛋白的橋，而肌醇在膜內(nèi)在細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白時(shí)，磷脂酶C可切割此類蛋白，有利于純化?,糖基化磷脂酰肌醇錨著點(diǎn)：它在膜與蛋白質(zhì)之間形成穩(wěn)定的相互作用,10,細(xì)胞特異性糖基化途徑——淋巴細(xì)胞中進(jìn)行，它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體IgG的糖基化，等分GlcNAc殘基連接在核心甘露糖上，該糖基化在抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性中起重要作用IgG蛋白的鉸鏈區(qū)，富含Ser、Thr和Pro，5個(gè)Ser全部糖基化促黃體激素、促甲狀腺素等的硫酸化只能在垂體中發(fā)生?,細(xì)胞特異性糖基化途徑——淋巴細(xì)胞中進(jìn)行，它不依賴于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高,11,盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細(xì)胞系，糖基化特征不同鼠和豬細(xì)胞傾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠雜交瘤或人鼠雜交瘤生產(chǎn)的抗體中，乙酰果糖占優(yōu)勢(shì)CHO,細(xì)胞不能合成等分,N-,乙酰葡萄糖胺，而鼠細(xì)胞系卻能形成半乳糖末端，對(duì)人有免疫原性要根據(jù)糖基化的結(jié)構(gòu)，選擇適宜的細(xì)胞系?,盡管哺乳動(dòng)物細(xì)胞具有細(xì)胞內(nèi)的糖基化裝置，但不同細(xì)胞系，糖基化,12,細(xì)胞系,,Fuc,,Gal,,唾液酸,,α1,6,,α1,3 Fuc,α1,3Gal,,SO,4,-GalNAc,α2,3,,,α2,6,糖基化,等分GluNAc,BHK,,++,,0,,+,,0,,++,,0,,-,,0,,CHO,,++,,-,,0,,0,,++,,0,,+,,0,,鼠雜交瘤,,++,,0,,++,,0,,++,,0,,+++,,0,,C127,,++,,0,,++,,++,,++,,++,,+++,,0,,J558L,,++,,0,,++,,-,,++,,++,,+++,,0,,人淋巴細(xì)胞,++,,0,,0,,0,,+,,+,,0,,++,,人垂體,,++,,0,,0,,+++,,+,,+,,0,,++,,Namalwa,,++,,0,,0,,0,,++,,++,,-,,-,,人鼠雜交瘤,++,,0,,0,,0,,+,,+,,+,,0,,,?,細(xì)胞系Fuc Gal唾液酸α1,6 α1,3 Fucα1,3,13,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng),基因工程哺乳動(dòng)物細(xì)胞系：失去分化能力的無(wú)限生長(zhǎng)細(xì)胞系，即永久性細(xì)胞。

表達(dá)的蛋白質(zhì)能正確加工、修飾并折疊形成具有生物活性的功能分子，接近或類似天然產(chǎn)物糖基化等修飾是糖蛋白行使功能所必需的，而且對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量有影響，如生物活性、穩(wěn)定性、免疫原性等原核細(xì)胞表達(dá)的EPO無(wú)糖基化，在體內(nèi)表現(xiàn)無(wú)活性原核表達(dá)的GM－CSF雖有活性，但在體內(nèi)產(chǎn)生抗體動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)液，容易分離純化約有70％批準(zhǔn)的蛋白質(zhì)藥物由哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)制造，而且數(shù)目還在不斷增加?,2. 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)?,14,表達(dá)系統(tǒng),,O-糖基化,,寡聚甘露糖,高甘露糖,復(fù)合體,,大腸桿菌,,0,,0,,0,,0,,釀酒酵母,,＋＋,,0,,＋＋＋＋,,－,,昆蟲(chóng)Sf9,,＋＋,,＋＋＋＋,,0,,－,,倉(cāng)鼠CHO,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,倉(cāng)鼠BHK,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠雜交瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,鼠骨髓瘤,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,C127,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,J558L,,＋＋,,－,,0,,＋＋,,人淋巴細(xì)胞,,＋＋,,0,,0,,＋,,Namalwa,,＋＋,,＋＋,,0,,＋＋,,人鼠雜交瘤,,－,,＋＋,,0,,＋＋,,,?,表達(dá)系統(tǒng)O-糖基化寡聚甘露糖高甘露糖復(fù)合體大腸桿菌0000釀,15,,,大腸桿菌,,酵母,,哺乳動(dòng)物細(xì)胞,,產(chǎn)物濃度,,高,,高,,低,,分子量,,低,,高,,高,,二硫鍵,,有限,,不受限制,,不受限制,,分泌,,無(wú),,有或無(wú),,有,,形式,,包涵體,,單鏈，天然,,單鏈，天然,,折疊,,不正確,,正確,,正確,,糖基化,,無(wú),,可能,,完全,,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,無(wú),,無(wú),,可能,,熱原,,可能,,無(wú),,無(wú),,培養(yǎng)特點(diǎn),,容易,,容易,,較難，成本高,,分離純化,,復(fù)雜,,復(fù)雜,,簡(jiǎn)單,,,?,大腸桿菌酵母哺乳動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)物濃度高高低分子量低高高二硫鍵有,16,細(xì)胞類型,,表達(dá)水平（μg/ml）,,猴CV1,,1～10,,猴CV1,,0.05,,猴COS,,1,,小鼠成纖維細(xì)胞C127,,1～5,,小鼠成纖維細(xì)胞3T3,,0.1～0.5,,CHO（dhfr,－,）,,0.01~0.05,,CHO（dhfr,－,）,,10,,,?,細(xì)胞類型表達(dá)水平（μg/ml）猴CV11～10猴CV10.0,17,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他表達(dá)系統(tǒng)。

骨髓細(xì)胞MPG－11生產(chǎn)IgG的能力為5pg/(細(xì)胞.分鐘)，10L反應(yīng)器，密度為107/ml，生產(chǎn)能力不到1g/d連續(xù)細(xì)胞系增加了生長(zhǎng)和代謝速率，但同時(shí)導(dǎo)致了副產(chǎn)物的增加動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求苛刻和敏感，對(duì)溫度、pH、滲透壓、剪切力等忍受能力差培養(yǎng)基要求高，需要添加氨基酸、維生素等，往往需要附加血清，提供生長(zhǎng)因子，費(fèi)用較高同時(shí)可能有潛在的致病因子、免疫原性存在表達(dá)載體的改進(jìn)和宿主細(xì)胞的改造是動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的研發(fā)重要內(nèi)容?,動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的不足是細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，生產(chǎn)效率較低，產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn),18,3. 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征,表達(dá)載體為昆蟲(chóng)病毒，轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞，表達(dá)出目標(biāo)蛋白質(zhì)昆蟲(chóng)病毒主要有桿狀病毒科核多角體病毒苜蓿尺蠖核多角體病毒－秋黏蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，家蠶核多角體病毒－家蠶幼蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)Micro－Gene Sys公司表達(dá)艾滋病基因工程疫苗，隨后豬生長(zhǎng)素、CD4膜蛋白及瘧疾疫苗、雞新城病毒疫苗、血吸蟲(chóng)GST疫苗、乙肝表面抗原、重組人GM－CSF等日本批準(zhǔn)用家蠶系統(tǒng)生產(chǎn)干擾素已上市生物試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品大多用昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)至少有600多種昆蟲(chóng)可以作為宿主，每年有數(shù)百個(gè)基因利用昆蟲(chóng)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，越來(lái)越成為非常有用的表達(dá)宿主。

?,3. 昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)與特征?,19,優(yōu)點(diǎn),1）安全：桿狀病毒無(wú)致病性，產(chǎn)品安全性受FDA認(rèn)可2）易飼養(yǎng)：家蠶喪失了野外生存能力，飼養(yǎng)，發(fā)育快，,3）高量表達(dá)：用強(qiáng)啟動(dòng)子，外源基因可超量表達(dá)表達(dá)產(chǎn)物在昆蟲(chóng)細(xì)胞內(nèi)能結(jié)晶，對(duì)產(chǎn)物純化非常有意義4）高效表達(dá)：可容納較大的外源基因（12kb），表達(dá)數(shù)個(gè)外源基因，并且正確裝配成有功能的分子如表達(dá)抗體的重鏈和輕鏈，自主裝配成有功能的抗體5）翻譯后的加工：昆蟲(chóng)細(xì)胞能進(jìn)行一系列翻譯后的加工，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸的乙?；?、氨酰化等，大部分產(chǎn)物顯示出良好的活性?,優(yōu)點(diǎn)?,20,缺點(diǎn)：,1,）重組率低，篩選困難，周期長(zhǎng)，需要,4,－,10,天2,）外源基因的表達(dá)在轉(zhuǎn)染的晚期，大約在,20h,后起始基因表達(dá)，在,72,－,94h,細(xì)胞裂解死亡，基因表達(dá)時(shí)間約,30,－,50h,，高水平表達(dá)不連續(xù)且時(shí)間短，這對(duì)表達(dá)不利3,）昆蟲(chóng)細(xì)胞糖基化等加工途徑與哺乳動(dòng)物細(xì)胞不完全相同，它不提供復(fù)雜的,N,糖基化，如添加半乳糖和唾液酸殘基，有可能造成溶解性、穩(wěn)定性、免疫性等變化表達(dá)水平非常高，加工裝備跟不上，蛋白質(zhì)修飾效率可能不高研究開(kāi)發(fā)的主要方向：有效的病毒表達(dá)載體；,決定基因表達(dá)時(shí)期啟動(dòng)子，無(wú)血清培養(yǎng)昆蟲(chóng)細(xì)胞系。

?,缺點(diǎn)：?,21,第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建,,,構(gòu)建高效表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞,篩選鑒定,獲得生產(chǎn)用工程化細(xì)胞系,,,,?,第二節(jié) 基因工程動(dòng)物細(xì)胞系的構(gòu)建 ?,22,動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體病毒載體：,逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、痘苗病毒、桿狀病毒等載體，對(duì)原始病毒改造而來(lái)同源重組構(gòu)建腺病毒載體，在靜止期轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)痘病毒載體可插入,25,～,40 kb,外源基因，甚至是多個(gè)基因無(wú)感染性和致癌性，可用于構(gòu)建基因工程疫苗美國(guó),Genentech,公司已用,SV40,載體生產(chǎn)乙肝疫苗，其他載體可用于基因治療?,動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)載體：病毒載體，質(zhì)粒載體?,23,質(zhì)粒載體：,微生物的質(zhì)粒載體類似，一般是穿梭質(zhì)粒，具有兩個(gè)復(fù)制子和抗性篩選標(biāo)記基因大腸桿菌的復(fù)制子，細(xì)菌中繁殖抗生素抗性標(biāo)記，原核細(xì)胞篩選動(dòng)物細(xì)胞的復(fù)制子，,在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)還有絲狀噬菌體復(fù)制子?,質(zhì)粒載體：?,24,啟動(dòng)子序列：含有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，以便有效轉(zhuǎn)錄TATA盒，確定起始位置；GG盒，影響轉(zhuǎn)錄頻率來(lái)源于病毒、動(dòng)物基因和噬菌體的啟動(dòng)子動(dòng)物病毒啟動(dòng)子：逆轉(zhuǎn)錄病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTRS）、SV40病毒的早期和晚期啟動(dòng)子、腺病毒的晚期啟動(dòng)子、人巨噬病毒（CMV）立即早期基因啟動(dòng)子。

動(dòng)物基因的啟動(dòng)子：轉(zhuǎn)錄因子EF-1α啟動(dòng)子、泛素蛋白啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、干擾素-α啟動(dòng)子、IgG啟動(dòng)子、鼠金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子等噬菌體T7啟動(dòng)子比動(dòng)物基因啟動(dòng)子表達(dá)水平高?,啟動(dòng)子序列：含有RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合位點(diǎn)，以便有效轉(zhuǎn)錄T,25,PolyA信號(hào)序列：保持mRNA的穩(wěn)定性，防止降解，保證了轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的加工和正確性，但序列不宜太長(zhǎng)，避免能量過(guò)度消耗添加PolyA信號(hào)和5′端轉(zhuǎn)錄暫停位點(diǎn)，可以減少上游序列轉(zhuǎn)錄通讀造成的背景牛生長(zhǎng)素（BGH）基因的PolyA信號(hào)比SV40 PolyA更強(qiáng)，常用于高效表達(dá)載體中終止序列：AAUAAA或連續(xù)的終止密碼UGA、UAA和UAG，能防止轉(zhuǎn)錄通讀，使轉(zhuǎn)錄在正確的位點(diǎn)結(jié)束在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游或下游使用相同類型的增強(qiáng)子，有利于提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平?,PolyA信號(hào)序列：保持mRNA的穩(wěn)定性，防止降解，保證了轉(zhuǎn),26,雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體：,兩個(gè)基因在同一啟動(dòng)子控制之下，內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)使同一,mRNA,中的第二個(gè)基因得到翻譯將,dhfr,與目標(biāo)基因串連，,dhfr,的,cDNA,插入內(nèi)含子中，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物被剪切，翻譯不出蛋白質(zhì)，而目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得到翻譯。

順?lè)醋釉诙鄟喕鞍椎呐悸?lián)表達(dá)及其控制策略等方面有廣泛應(yīng)用前景使篩選容易，而且能高效表達(dá)?,雙順?lè)醋颖磉_(dá)載體：?,27,選擇適宜的啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)定向表達(dá)CMV啟動(dòng)子和人EF-1α啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)同一載體上的二個(gè)基因的獨(dú)立表達(dá)組織特異性啟動(dòng)子：如鼠、山羊酪蛋白啟動(dòng)子，可使基因主要在乳腺中表達(dá)N端設(shè)計(jì)分泌信號(hào)肽：如Ig κ鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)之間序列，使外源基因的表達(dá)產(chǎn)物向胞外分泌C端設(shè)計(jì)跨膜錨定序列：可使外源蛋白展示在細(xì)胞表面亞細(xì)胞定位信號(hào)肽：目標(biāo)基因產(chǎn)物將轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)胞質(zhì)中，這對(duì)基因的功能研究非常合適?,選擇適宜的啟動(dòng)子，可實(shí)現(xiàn)定向表達(dá)?,28,基因的擴(kuò)增系統(tǒng)：,在逐漸提高選擇壓的情況下，使選擇標(biāo)記基因拷貝數(shù)增加，并可連帶其兩側(cè)序列一起擴(kuò)增，從而提高表達(dá)基因水平最常用二氫葉酸二氫葉酸還原酶（,DHFR,）基因系統(tǒng)和谷氨酰氨合成酶（,GS,）基因系統(tǒng)氨甲喋呤基因與目標(biāo)基因重組，氨甲喋呤使,dhfr,基因與目標(biāo)基因大量增加，達(dá)到數(shù)千拷貝硫胺蛋氨酸使,GS,系統(tǒng)的基因得到大量擴(kuò)增?,基因的擴(kuò)增系統(tǒng)：?,29,二、受體細(xì)胞,1．人源細(xì)胞株系,Namalwa：類淋巴母細(xì)胞，非整體核型。

表達(dá)IgM，懸浮生長(zhǎng)外源基因的表達(dá)水平較高，可用無(wú)血清培養(yǎng)基高密度培養(yǎng)，已成功地表達(dá)了rhEPO、rhG-CSF、tPA等英國(guó)Wellcome公司用Namalwa細(xì)胞的反應(yīng)器達(dá)8000L，用Sendai病毒誘導(dǎo)，大規(guī)模生產(chǎn)α干擾素，并批準(zhǔn)上市WI-38：二倍體成纖維細(xì)胞系，2n=46，第一個(gè)被用于制備疫苗貼壁生長(zhǎng)，對(duì)很多病毒敏感，廣泛用于疫苗生產(chǎn)MRC-5：二倍體成纖維細(xì)胞系，但生長(zhǎng)較WI-38快，對(duì)逆境有一定抗性也用于制備疫苗?,二、受體細(xì)胞?,30,2．哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系,CHO細(xì)胞：中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢中分離的上皮樣細(xì)胞系，貼壁型生長(zhǎng)，是目前使用最為普遍和成熟的表達(dá)糖基化蛋白藥物的宿主細(xì)胞核型為亞二倍體，分泌表達(dá)外源蛋白，而內(nèi)源蛋白分泌很少貼壁型生長(zhǎng)細(xì)胞，但可進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，對(duì)剪切力和滲透壓有較高的忍受能力蛋白質(zhì)翻譯后的修飾準(zhǔn)確，表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和生物活性接近天然有多種衍生突變株應(yīng)用于藥物的生產(chǎn)，培養(yǎng)時(shí)需要添加脯氨酸二氫葉酸還原酶缺陷株表達(dá)的藥物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子Ⅷ、DNA酶Ⅰ，已上市使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷貝數(shù)，提高蛋白質(zhì)表達(dá)水平?,2．哺乳動(dòng)物細(xì)胞株系?,31,BHK－21：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體。

用于增殖病毒、制備疫苗和重組蛋白BHK-21表達(dá)的重組凝血因子Ⅷ已被獲準(zhǔn)上市C127：從小鼠乳腺腫瘤中分離獲得的上皮樣細(xì)胞，貼壁型生長(zhǎng)C127細(xì)胞系已表達(dá)多種外源基因，其中EPO的水平達(dá)10 mg/L，生產(chǎn)rhGH已被批準(zhǔn)上市3T3,：,HIN Swiss,小鼠胚胎培養(yǎng)物中分離建立的連續(xù)細(xì)胞系，能大量表達(dá)外源蛋白，廣泛用于藥物毒理學(xué)研究骨髓瘤細(xì)胞：,J558L,是小鼠,BALB/c,骨髓瘤細(xì)胞，分泌,IgA,，用于轉(zhuǎn)染研究NSO,和,SP2/O,－,Ag14,不分泌,Ig,，與淋巴細(xì)胞融合篩選雜交瘤，分泌制備特異性抗體?,BHK－21：幼倉(cāng)鼠腎臟中分離的成纖維樣細(xì)胞，非整倍體用于,32,雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交瘤細(xì)胞系，能在無(wú)血清培養(yǎng)基中高密度懸浮生長(zhǎng)，容易轉(zhuǎn)染和生長(zhǎng)，能進(jìn)行糖基化等加工修飾，大量分泌和高效表達(dá)很多雜交瘤細(xì)胞系用于抗體的制備Vero：從成年非洲綠猴腎中分離獲得的貼壁型成纖維細(xì)胞，多倍體核型，能適應(yīng)灌流操作，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)已有突變細(xì)胞系能用無(wú)血清培養(yǎng)最為常用Vero E6增殖多種病毒，如脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒、乙腦病毒等，生產(chǎn)病毒性疫苗，已被批準(zhǔn)用于人體。

也可作為轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞，用于表達(dá)外源基因的蛋白質(zhì)藥物和病毒的檢測(cè)COS,：是從,SV40 DNA,轉(zhuǎn)化的非洲綠猴腎細(xì)胞,CV1,中分離得到的，廣泛用于外源基因瞬時(shí)表達(dá)的研究GH3用于生長(zhǎng)激素研究，293細(xì)胞系用于基因治療的研究?,雜交瘤細(xì)胞：從小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的融合細(xì)胞中分離獲得雜交,33,3．昆蟲(chóng)細(xì)胞株系,Sf21：從秋粘蟲(chóng)卵巢細(xì)胞中分離得到，細(xì)胞較大，容易放大，高效表達(dá)外源基因Sf9：從秋粘蟲(chóng)的卵巢細(xì)胞（SF21）中分離得到，是最常用的昆蟲(chóng)表達(dá)細(xì)胞對(duì)桿狀病毒高度敏感，生長(zhǎng)快，能高效表達(dá)外源基因抗機(jī)械剪切，能在無(wú)血清培養(yǎng)基的攪拌反應(yīng)器中生長(zhǎng)TN-5B1-4：從粉紋夜蛾卵細(xì)胞勻漿中分離得到，無(wú)血清培養(yǎng)，快速倍增分泌表達(dá)重組蛋白的能力比Sf9細(xì)胞系高20多倍，能適應(yīng)懸浮培養(yǎng)?,3．昆蟲(chóng)細(xì)胞株系?,34,三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染（是將外源基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞的技術(shù)通用名稱基因?qū)胝婧思?xì)胞的方法很多，主要有化學(xué)轉(zhuǎn)染、物理轉(zhuǎn)染和病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法,,表達(dá)類型,,毒性,,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,基因槍,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞組織，器官,,有效，儀器操作,,顯微注射,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞,,有效，技術(shù)難度大,,電穿孔,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞,,有效，儀器操作,,沖擊波,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,多種細(xì)胞，局部組織,,簡(jiǎn)單有效，儀器操作,,,?,三、細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)基因槍瞬時(shí)，穩(wěn)定無(wú)多,35,方法,,表達(dá)類型,,毒性,,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,逆轉(zhuǎn)錄病毒,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,對(duì)應(yīng)的宿主細(xì)胞,,有效,,原生質(zhì)體融合,,瞬時(shí)，穩(wěn)定,,無(wú),,懸浮細(xì)胞,,技術(shù)復(fù)雜,,生物轉(zhuǎn)染特點(diǎn),,?,方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)逆轉(zhuǎn)錄病毒瞬時(shí)，穩(wěn)定無(wú)對(duì)應(yīng)的宿主,36,化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法。

其基本原理是磷酸鈣、二乙氨乙基（,DEAE,）－葡聚糖（,dextran,）和陽(yáng)離子樹(shù)脂與核酸形成復(fù)合物，附著于細(xì)胞表面，通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞磷酸鈣與,DNA,形成不溶性沉淀，帶正電荷的,DEAE,－葡聚糖與帶負(fù)電荷的,DNA,磷酸基團(tuán)結(jié)合，陽(yáng)離子樹(shù)脂包裹,DNA,形成脂質(zhì)體滲透性休克和,DMSO,等化學(xué)試劑能促進(jìn),DNA,進(jìn)入細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒商業(yè)化供應(yīng)，特別是脂質(zhì)體材料的轉(zhuǎn)染試劑影響因素：細(xì)胞培養(yǎng)物的密度、,DNA,的大小、純度與用量、化學(xué)試劑的用量與處理時(shí)間、促進(jìn)劑的使用等?,化學(xué)轉(zhuǎn)染是最常用的轉(zhuǎn)染方法?,37,方法,,表達(dá)類型,,毒性,,細(xì)胞類型,,特點(diǎn),,磷酸鈣,,瞬時(shí)、穩(wěn)定,,無(wú),,貼壁細(xì)胞，懸浮細(xì)胞,,簡(jiǎn)單,,DEAE-葡聚糖,,瞬時(shí),,有,,CV1，COS,,簡(jiǎn)單,,陽(yáng)離子樹(shù)脂,,瞬時(shí)、穩(wěn)定,,有或無(wú),,貼壁、原代懸浮細(xì)胞,,簡(jiǎn)單，有效,,化學(xué)轉(zhuǎn)染的特點(diǎn),,?,方法表達(dá)類型毒性細(xì)胞類型特點(diǎn)磷酸鈣瞬時(shí)、穩(wěn)定無(wú)貼壁細(xì)胞，懸浮,38,四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離,轉(zhuǎn)染后1～6天收獲細(xì)胞，進(jìn)行核酸分子雜交或蛋白質(zhì)雜交，檢測(cè)外源基因的瞬時(shí)表達(dá)為了獲得穩(wěn)定整合的細(xì)胞系，先在非選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)24～48小時(shí)，讓細(xì)胞倍增1～2代，使轉(zhuǎn)染DNA表達(dá)。

再按1：15比例轉(zhuǎn)移到選擇性培養(yǎng)基上，每2～4天更換培養(yǎng)基，持續(xù)2～3周，促進(jìn)抗性細(xì)胞生長(zhǎng)，清除死細(xì)胞殘骸，最后得到獨(dú)立的克隆在轉(zhuǎn)染中大約有萬(wàn)分之一的細(xì)胞將穩(wěn)定整合外源基因，因此需要顯性選擇標(biāo)記來(lái)分離轉(zhuǎn)染細(xì)胞哺乳動(dòng)物細(xì)胞的選擇標(biāo)記，使用與之相對(duì)應(yīng)的選擇劑?,四、轉(zhuǎn)染體篩選與分離?,39,選擇劑,,基因,,使用濃度,,氨甲喋呤,,dhfr,－,,0.01～300 μmol/L,,氨喋呤,,tk,＋,,0.4 μmol/L,,5-溴脫氧尿苷,,tk,－,,30 μg/ml,,G418, Zeocin,,neo,,100～800 μg/ml,,潮霉素B,,hyg,,10～400 μg/ml,,殺瘟稻菌素,,bsd,,2～10 μg/ml,,霉酚酸,,gpt,,25 μg/ml,,嘌呤霉素,,乙酰基轉(zhuǎn)移酶,,0.5～10 μg/ml,,Xyl-A,,ada,,4 μmol/L,,,?,選擇劑基因使用濃度氨甲喋呤dhfr－0.01～300 μmo,40,報(bào)告基因,,特點(diǎn),,使用與分析方法,,cat,,內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范圍窄，,體外，熒光或免疫分析,,lacZ,,有內(nèi)源活性，X-gal染色，線性范圍寬,,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,堿性磷酸酶,,分泌型，線性范圍寬，受到細(xì)胞類型限制,體外，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gus,,蛋白質(zhì)穩(wěn)定，線性范圍寬，X-Gluc染色,體內(nèi)外，染色，比色、化學(xué)發(fā)光或熒光分析,gfp,,無(wú)內(nèi)源活性，分子量小，穩(wěn)定，無(wú)需底物，紫外線激發(fā),體內(nèi)外，熒光分析,,,?,報(bào)告基因特點(diǎn)使用與分析方法cat內(nèi)源活性低，蛋白穩(wěn)定，線性范,41,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備,,動(dòng)物細(xì)胞離體后，失去了消化等系統(tǒng)，不能利用多糖、蛋白質(zhì)等聚合程度高的化合物。

只能利用簡(jiǎn)單的單體化合物如單糖、氨基酸等，為了維持細(xì)胞正常生長(zhǎng)，還必須添加維生素、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境的要求高，不同細(xì)胞系的要求也不盡相同，培養(yǎng)基要盡可能與體內(nèi)生活條件接近?,第三節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的需求與培養(yǎng)基的制備?,42,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求,,1.糖類,糖類是細(xì)胞主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分解后釋放出能量ATP培養(yǎng)基中都必須添加葡萄糖，有時(shí)添加核糖等提高細(xì)胞生長(zhǎng)的碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺?,一、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的營(yíng)養(yǎng)需求?,43,2. 氨基酸,氨基酸是蛋白質(zhì)和酶的組成單位氨基酸還參與合成一些含氮化合物，核苷酸的四種嘌呤和嘧啶堿基、兒茶酚胺等含氮激素及神經(jīng)遞質(zhì)等氨基酸可通過(guò)生糖或生酮途徑轉(zhuǎn)變?yōu)樘腔蛑舅?，間接提供能量動(dòng)物細(xì)胞：8－10種必須氨基酸離體容易失去，20種氨基酸中至少12種是必需氨基酸：,精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸等谷氨酰胺還可作為重要的碳源和能源而被利用?,2. 氨基酸?,44,3. 維生素,維生素是一類微量的小分子有機(jī)生物活性物質(zhì)，對(duì)代謝和生長(zhǎng)起調(diào)節(jié)和控制作用。

水溶性維生素包括B族維生素和維生素CB族維生素以輔酶或輔基形式參與酶反應(yīng)，主要調(diào)節(jié)酶活性和代謝活性維生素C，抗壞血酸，在體內(nèi)參與還原反應(yīng)、羥化反應(yīng)，促進(jìn)膠原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用脂溶性維生素包括維生素A、D、E、K四種維生素A維持正常視覺(jué)和上皮組織維生素D為視固醇類化合物，主要是調(diào)節(jié)鈣磷代謝維生素E即生育酚，是抗氧化劑，防止生物膜中磷脂的不飽和脂肪酸被氧化維生素K，促進(jìn)合成凝血酶原，促進(jìn)血液凝固?,3. 維生素?,45,5. 無(wú)機(jī)鹽類,無(wú)機(jī)鹽是細(xì)胞代謝所需的酶的輔基，同時(shí)保持細(xì)胞的滲透壓和緩沖pH的變化Na,＋,和Cl,－,參與生理電活動(dòng)，維持水平衡、保持滲透壓和酸堿平衡離體培養(yǎng)為細(xì)胞提供足夠的Na和Cl離子是基本條件，一般生理鹽水的離子濃度（0.9% NaCl）Ca,2＋,、Mg,2＋,，對(duì)細(xì)胞間的互黏穩(wěn)定起重要作用在離體培養(yǎng)時(shí)，螯合細(xì)胞間的Ca,2＋,和Mg,2＋,，可以達(dá)到分散細(xì)胞的目的磷是核酸、磷脂等的組成成分碳酸鹽緩沖液是重要的體內(nèi)緩沖體系，與K,＋,、Cl,－,等在維持酸堿平衡具有重要作用?,5. 無(wú)機(jī)鹽類?,46,6. 生長(zhǎng)類因子及激素,細(xì)胞之間是相互聯(lián)系的，而非孤立的。

特別是高度分化功能的動(dòng)物細(xì)胞更是如此細(xì)胞離體生長(zhǎng)時(shí)，必要添加激素與細(xì)胞生長(zhǎng)因子等胰島素是最常用的激素，促進(jìn)糖原和脂肪酸的合成，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有刺激作用其它激素有促卵泡激素、甲狀腺素、乳激素、生育酚等細(xì)胞因子有表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，根據(jù)不同細(xì)胞添加為了細(xì)胞的貼壁生長(zhǎng)，必需添加貼附因子，纖維結(jié)合蛋白、膠原等，伸展因子如表皮生長(zhǎng)因子、成纖維細(xì)胞因子等?,6. 生長(zhǎng)類因子及激素 ?,47,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境需求,1. 水與滲透壓,細(xì)胞生長(zhǎng)離不開(kāi)水，水是細(xì)胞反應(yīng)的重要介質(zhì)1）水是一種良好的溶媒，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在水中被吸收，廢物在水中被排泄2）具有熱穩(wěn)定性和導(dǎo)熱性，調(diào)節(jié)穩(wěn)定溫度正常血漿滲透壓主要是無(wú)機(jī)鹽Na,＋,、K,＋,、Cl,－,、HCO,3,－,等構(gòu)成，蛋白質(zhì)構(gòu)成膠體滲透壓較小動(dòng)物細(xì)胞對(duì)滲透壓有較強(qiáng)的耐受性，常用增減NaCl的濃度調(diào)整滲透壓，每增加1mg/ml NaCl，滲透壓增加32 mOsm/kg離體培養(yǎng)細(xì)胞的滲透壓應(yīng)控制為等滲透溶液?,二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境需求?,48,2. 溫度,不同種類的動(dòng)物細(xì)胞對(duì)溫度的要求是不同的，變溫動(dòng)物對(duì)溫度要求沒(méi)有恒溫動(dòng)物嚴(yán)格哺乳動(dòng)物細(xì)胞最佳培養(yǎng)溫度為37,℃，雞細(xì)胞為39－40℃，而昆蟲(chóng)類細(xì)胞為25－28℃。

在培養(yǎng)過(guò)程中，根據(jù)細(xì)胞種類選擇確定適宜的培養(yǎng)溫度哺乳動(dòng)物細(xì)胞的耐受溫度范圍較窄，在,35-37,℃內(nèi)能正常進(jìn)行代謝和生長(zhǎng)，超出范圍會(huì)引起細(xì)胞傷害甚至死亡細(xì)胞對(duì)低溫的耐受性比高溫要強(qiáng)，低溫抑制生長(zhǎng)，但無(wú)傷害作用，在冰點(diǎn)溫度附近仍能存活?,2. 溫度?,49,3. 氧氣,動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)必須有氧氣，無(wú)氧下，能獲得能量供應(yīng)，但細(xì)胞缺氧時(shí)不能生存離體培養(yǎng)的氣體含有5％CO,2,和95％空氣，其中氧濃度為21％有時(shí)充以N,2,氣稀釋O,2,濃度O,2,濃度在60%以上為高氧環(huán)境，對(duì)細(xì)胞毒性較大4. pH值,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)pH值很敏感，低于6.8或超過(guò)7.6會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重影響機(jī)體細(xì)胞的pH范圍為6－8，血液和體液中，變化范圍很小人血液pH維持7.36-7.44pH低于7.05會(huì)發(fā)生酸中毒，高于7.45發(fā)生堿中毒細(xì)胞代謝產(chǎn)生CO,2,，使培養(yǎng)液變酸，pH發(fā)生波動(dòng)合成培養(yǎng)基偏酸性，為了穩(wěn)定pH，可用緩沖體系配制在開(kāi)放體系中，CO,2,逸出，使培養(yǎng)基變堿通入5％CO,2,，可維持在pH7.2-7.4范圍內(nèi)?,3. 氧氣?,50,5. 生長(zhǎng)基質(zhì),改變生長(zhǎng)表面特性，促進(jìn)細(xì)胞貼附的物質(zhì)貼附細(xì)胞生長(zhǎng)需要一個(gè)支持介質(zhì)，采用在培養(yǎng)液中添加或在器皿表面覆蓋生長(zhǎng)基質(zhì)，幫助細(xì)胞的貼附和生長(zhǎng)。

生長(zhǎng)基質(zhì)為胞外基質(zhì)成分，多聚賴氨酸、纖維連接蛋白、膠原、層黏蛋白、韌黏素等生長(zhǎng)基質(zhì)已有商業(yè)化產(chǎn)品，,用PBS或BBS配成10倍貯存液，在37,℃下包被，靜置2－4小時(shí)或室溫過(guò)夜，對(duì)器皿表面進(jìn)行包被，然后無(wú)菌生理鹽水洗滌后使用有些還可以直接加入培養(yǎng)液?,5. 生長(zhǎng)基質(zhì)?,51,生長(zhǎng)基質(zhì),,貯存液濃度,,使用濃度,,使用方法,,多聚賴氨酸,,0.5 mg/L,,0.05 mg/L,,表面包被,,纖維連接蛋白,,10 mg/ml,,1 mg/ml,,加入培養(yǎng)液,,層粘蛋白,,,,5～10 μg/ml,,表面包被,,韌粘素,,75 μg/ml,,5～15 μg/ml,,包被或加入培養(yǎng)液,,膠原蛋白,,1～3 mg/ml,,0.1 mg/ml,,表面包被,,,?,生長(zhǎng)基質(zhì)貯存液濃度使用濃度使用方法多聚賴氨酸0.5 mg/L,52,6．抗生素,動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)豐富，很容易被微生物污染雖然對(duì)使用抗生素仍存在質(zhì)疑，但還是常添加抗生素，以避免輕度污染抗生素使用濃度差別很大，一般范圍為50～100 μg/ml在大規(guī)模生產(chǎn)中，除了青霉素和β-內(nèi)酰胺類抗生素外，其它抗生素可以使用抗生素使用對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性，而且使實(shí)驗(yàn)室保留抗藥性微生物，應(yīng)加以注意和克服。

?,6．抗生素?,53,抗生素,,作用對(duì)象,,工作濃度（μg/ml）,,穩(wěn)定性（天）,,兩性霉素B,,真菌,,1～2.5,,3,,制霉菌素,,真菌,,50,,3,,氨芐青霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,3,,紅霉素,,G,＋,細(xì)菌，支原體,,100,,3,,四環(huán)素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌，支原體,,10,,4,,慶大霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌，支原體,,50,,5,,利福平,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,50,,3,,卡那霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,5,,鏈霉素,,G,＋,、G,－,細(xì)菌,,100,,3,,氯霉素,,G,－,細(xì)菌,,5,,5,,青霉素G,,G,＋,細(xì)菌,,100,,3,,,?,抗生素作用對(duì)象工作濃度（μg/ml）穩(wěn)定性（天）兩性霉素B真,54,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成,動(dòng)物細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求高，不同細(xì)胞系的要求也不盡相同，因此培養(yǎng)基成分復(fù)雜而且昂貴但是要盡可能提供與體內(nèi)生活條件接近的培養(yǎng)環(huán)境主要組成成分如下：,糖類、必需氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)鹽類、生長(zhǎng)類因子及激素、結(jié)合蛋白質(zhì)、貼附與伸展因子及其它附加成分等不同細(xì)胞對(duì)葡萄糖利用相似，但對(duì)氨基酸的利用相差很大，不同的細(xì)胞過(guò)程對(duì)氨基酸的需求存在差別。

目前停留在流加谷氨酰胺上,?,三、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基的種類與組成?,55,血清：蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素和生長(zhǎng)因子等胎牛血清、新生?；虺膳Ｑ濉ⅠR血清、雞血清、羊血清及人血清，最廣泛應(yīng)用的為胎牛血清和新生牛血清水解乳蛋白和膠原富含氨基酸血清和水解酪蛋白應(yīng)用于許多細(xì)胞系和原代及傳代細(xì)胞培養(yǎng)脂類化合物對(duì)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)是必需的，實(shí)際中類脂及其前體和血清常平行使用添加的蛋白質(zhì)試劑主要有鐵傳遞蛋白，起離子載體的作用，有時(shí)用無(wú)機(jī)鐵鹽代替胰島素起生長(zhǎng)素的作用，白蛋白起保護(hù)劑作用其他附加成分如核苷類及丙酮酸鹽等是培養(yǎng)基的必需成分，有助于細(xì)胞克隆和特異化細(xì)胞的培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，被微生物污染常添加抗生素，以避免輕度污染?,血清：蛋白質(zhì)、氨基酸、葡萄糖、激素和生長(zhǎng)因子等胎牛血清、新,56,1. 天然培養(yǎng)基,直接取自于動(dòng)物組織提取液或體液作為培養(yǎng)基，如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸出液等營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，成分復(fù)雜，不穩(wěn)定，來(lái)源受到限制，不宜大量培養(yǎng)和生產(chǎn)使用2. 合成培養(yǎng)基,合成培養(yǎng)基用化學(xué)成分明確的試劑配制的培養(yǎng)基，組分穩(wěn)定現(xiàn)在已有幾十種合成培養(yǎng)基，大部分已商品化組成：無(wú)機(jī)鹽、糖、氨基酸、維生素及其他成分由于細(xì)胞種類和培養(yǎng)條件不同，所用合成培養(yǎng)基也不同，在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中最常用培養(yǎng)基有7－8種。

?,1. 天然培養(yǎng)基?,57,3. 無(wú)血清培養(yǎng)基,無(wú)血清培養(yǎng)基是全部用已知成分組配的、不加血清的合成培養(yǎng)基在含有營(yíng)養(yǎng)和貼壁因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入適宜的細(xì)胞生長(zhǎng)因子，細(xì)胞良好生長(zhǎng)，適合于制藥生產(chǎn)無(wú)血清培養(yǎng)基提高了培養(yǎng)的質(zhì)量，避免了使用血清帶來(lái)的麻煩，產(chǎn)品純化容易，組分穩(wěn)定，可大量配制無(wú)血清培養(yǎng)基通常需要添加激素與生長(zhǎng)因子、結(jié)合蛋白、貼壁與伸展因子、低分子營(yíng)養(yǎng)成分等大多數(shù)無(wú)血清培養(yǎng)基含有蛋白質(zhì)和激素等大分子物質(zhì)，適宜于多種細(xì)胞系的培養(yǎng)對(duì)于大規(guī)模生產(chǎn)用的無(wú)血清培養(yǎng)基，往往成分不完全清楚，但簡(jiǎn)單而且低成本?,3. 無(wú)血清培養(yǎng)基?,58,四、培養(yǎng)基的控制,1. 培養(yǎng)用水質(zhì),細(xì)胞培養(yǎng)水質(zhì)最低要求電導(dǎo)率在1X10,6,Ω cm以上水存放時(shí)間不宜超過(guò)2周對(duì)于制藥，必需使用純凈水配制培養(yǎng)基，普通水必需除去各類元素有毒或有害物質(zhì)及微生物，還必需除熱源，達(dá)到純凈水標(biāo)準(zhǔn)2. 緩沖液,緩沖液：弱酸與弱酸鹽或弱堿與弱堿鹽組成的，pH恒定但不干擾試驗(yàn)不同種類細(xì)胞對(duì)pH 要求不一致，不同生長(zhǎng)階段對(duì)pH要求也不同原代細(xì)胞pH要求嚴(yán)格，而傳代細(xì)胞要求較寬細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中代謝產(chǎn)生酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的pH不斷下降緩沖液中和培養(yǎng)液中的酸性物質(zhì)。

?,四、培養(yǎng)基的控制?,59,最廣泛使用為碳酸氫鈉/碳酸,其次為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，調(diào)節(jié)二者的比例，配制成不同pH緩沖液碳酸鹽緩沖液除了直接的緩沖作用外，還有間接作用，碳酸生成揮發(fā)性CO,2,后很快逸出細(xì)胞呼吸產(chǎn)生的CO,2,與水形成碳酸，任何堿在培養(yǎng)液中都被中和，生產(chǎn)相應(yīng)碳酸氫鹽,其他緩沖液:Tricine-Glycine、MOPS 、TES 、HEPES 、DIPSO 、HEPPSO 等等有機(jī)緩沖液，緩沖能力強(qiáng)Tris所含氨基具有高的化學(xué)反應(yīng)活性，能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，并通過(guò)生物膜，它調(diào)節(jié)pH要依賴于溫度的變化，因此不宜作為培養(yǎng)液離體培養(yǎng)中，緩沖液多為平衡鹽溶液的重要組分之一，很少單純使用?,最廣泛使用為碳酸氫鈉/碳酸,其次為磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，調(diào),60,3. 生理鹽水與平衡鹽溶液,在緩沖液的基礎(chǔ)上，添加調(diào)節(jié)滲透壓的鹽類，在一定程度上能滿足細(xì)胞對(duì)pH和鹽離子要求緩沖液或緩沖鹽溶液用于:配制溶液, 處理細(xì)胞的溶液對(duì)于直接接觸、長(zhǎng)期培養(yǎng)的培養(yǎng)液，常用生理鹽水和平衡鹽溶液，是滲透壓與胞漿滲透壓平衡的溶液生理鹽水供給細(xì)胞水分和各種離子，維持一定滲透壓，并能良好溶解試劑和藥物有各種不同成分的生理鹽水，分別加入pH緩沖劑與指示劑、葡萄糖，形成平衡鹽溶液。

平衡鹽溶液：集緩沖液的緩沖能力、生理鹽水的等滲能力、營(yíng)養(yǎng)供給為一體，具有多種功能和作用?,3. 生理鹽水與平衡鹽溶液?,61,BSS配制：,1）先分別溶解CaCl,2,、MgCl,2,、MgSO,4,2）在另一容器中依次溶解其他試劑3）在另一容器中用5.6% NaHCO,3,數(shù)滴溶解酚紅4）將含Ca,2+,、Mg,2+,溶液緩慢倒入步驟2配制的溶液中，攪拌，防止沉淀5）再加入酚紅溶液6）補(bǔ)足水，并用NaHCO,3,調(diào)節(jié)pH含葡萄糖的BSS過(guò)濾除菌，不含葡萄糖時(shí)常規(guī)高壓滅菌小量培養(yǎng)液可置4度保存一旦出現(xiàn)沉淀，要重新配制?,BSS配制：?,62,注意事項(xiàng)：,細(xì)胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，對(duì)于DL混合型氨基酸，使用量應(yīng)該加倍谷氨酰胺溶液中很不穩(wěn)定，要單獨(dú)配制成濃縮液NaHCO,3,一般配成3.7％、5.6%、7.4%三種濃度，過(guò)濾除菌或高壓滅菌，4度保存，使用前加入，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH為了優(yōu)化細(xì)胞生長(zhǎng)環(huán)境，還添加其他成分，如嘌呤和嘧啶類，維生素C、谷胱甘肽、巰基乙醇一般情況下，培養(yǎng)基成分如氨基酸、維生素、葡萄糖、緩沖液等、補(bǔ)充因子幾類，先配制成高倍濃縮的母液，過(guò)濾滅菌，冷藏使用時(shí)按一定比例稀釋，配制成工作液。

?,注意事項(xiàng)：?,63,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程,一、單細(xì)胞生長(zhǎng)增殖周期,從一個(gè)細(xì)胞分裂形成兩個(gè)新細(xì)胞的過(guò)程為一個(gè)細(xì)胞周期或一個(gè)細(xì)胞世代單個(gè)細(xì)胞周期包括細(xì)胞間期、細(xì)胞分裂期，間期又包括間期1、DNA合成期和間期2三個(gè)時(shí)期不同的細(xì)胞類型其分裂周期及各期的時(shí)間都不同，培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基成分也會(huì)影響細(xì)胞周期,,,一般地動(dòng)物細(xì)胞分裂周期為,12,－,48,小時(shí),,,典型的細(xì)胞周期為,24,小時(shí)對(duì)連續(xù)細(xì)胞系，失去了細(xì)胞周期控制，人工培養(yǎng)條件不適，細(xì)胞將發(fā)生程序化死亡即凋亡在培養(yǎng)過(guò)程中，缺乏生長(zhǎng)因子或血清、營(yíng)養(yǎng)受限和逆境等可引發(fā)凋亡發(fā)生?,第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)過(guò)程?,64,二、細(xì)胞群體的生長(zhǎng)過(guò)程,細(xì)胞群體生長(zhǎng)增殖過(guò)程與微生物的生長(zhǎng)增殖過(guò)程相似,1. 潛伏期，細(xì)胞經(jīng)歷一段懸浮狀態(tài)，貼附于器皿表面2. 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：細(xì)胞分裂旺盛，指數(shù)增加細(xì)胞相互接觸匯合成片，接觸抑制，限制分裂和運(yùn)動(dòng)，密度不再增加3. 靜止期 ：分裂數(shù)與死亡數(shù)相等的相對(duì)動(dòng)態(tài)平衡時(shí)期4.衰亡期：細(xì)胞死亡數(shù)目大于分裂數(shù)目的時(shí)期三、群體細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)參數(shù),細(xì)胞分裂代數(shù)G就可用下列公式計(jì)算：,G＝logN－logN0）/log2,,?,二、細(xì)胞群體的生長(zhǎng)過(guò)程?,65,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng),一、細(xì)胞的種類,生物體是由多種多樣的分化細(xì)胞構(gòu)成，如人體的細(xì)胞類型達(dá)200余種。

這些細(xì)胞都是由受精卵分裂產(chǎn)生的細(xì)胞后代生長(zhǎng)增殖分化而來(lái)不同細(xì)胞具有不同的功能，細(xì)胞分化異常導(dǎo)致癌變分化程度越高，脫分化的能力越差在胚胎發(fā)育過(guò)程中，高等動(dòng)物細(xì)胞的分化是由全能性變成多能性，再變成單能性，進(jìn)而失去再分化的能力雖然成熟細(xì)胞不能再分化，但其細(xì)胞核仍然具有全能性，因此可以通過(guò)核移植，克隆動(dòng)物?,第四節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的分離與培養(yǎng)?,66,體外培養(yǎng)細(xì)胞，可分為原代細(xì)胞系、傳代細(xì)胞原代培養(yǎng)：,從體內(nèi)取出的組織細(xì)胞進(jìn)行體外接種培養(yǎng)，原代培養(yǎng)的細(xì)胞為原代細(xì)胞，它生長(zhǎng)分裂并不旺盛，與體內(nèi)細(xì)胞相似，適合于藥物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)中有些產(chǎn)品仍沿用原代細(xì)胞，如雞胚細(xì)胞，兔或鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞傳代細(xì)胞:,原代細(xì)胞轉(zhuǎn)接后培養(yǎng)的細(xì)胞傳代后，細(xì)胞分裂增殖旺盛，能保持一致的二倍體核型，所以又成為二倍體細(xì)胞系傳代細(xì)胞的增殖能力有限，所以也稱為有限細(xì)胞系如WI－38、MRC－5、2BS等用于生產(chǎn)?,體外培養(yǎng)細(xì)胞，可分為原代細(xì)胞系、傳代細(xì)胞?,67,根據(jù)細(xì)胞的傳代次數(shù)和壽命，可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù)細(xì)胞系有限細(xì)胞系:正常細(xì)胞經(jīng)過(guò)多次傳代后，一般可連續(xù)培養(yǎng)30－50代，就會(huì)逐漸失去增殖能力，也就是說(shuō)它們只能生長(zhǎng)有限的時(shí)間，經(jīng)過(guò)若干傳代培養(yǎng)后將老化死亡。

無(wú)限細(xì)胞系：當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)自然或人為的因素轉(zhuǎn)化為異倍體后，才能變?yōu)闊o(wú)限細(xì)胞系如腫瘤細(xì)胞就是自發(fā)形成的永久細(xì)胞系，沒(méi)有分裂次數(shù)的限制物理、化學(xué)或生物因素也能獲得細(xì)胞壽命無(wú)限，生長(zhǎng)不受細(xì)胞密度的影響，倍增時(shí)間短不具接觸抑制現(xiàn)象，它對(duì)培養(yǎng)條件和生長(zhǎng)因子等要求低，，非常適合于工業(yè)化生產(chǎn)，理想的藥物生產(chǎn)細(xì)胞系?,根據(jù)細(xì)胞的傳代次數(shù)和壽命，可分為有限細(xì)胞系和無(wú)限細(xì)胞系或連續(xù),68,根據(jù)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)特性和對(duì)基質(zhì)的依賴性，可分為貼壁依賴性細(xì)胞和非貼壁依賴性細(xì)胞貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)需要在適量帶電荷的固體或半固體支持表面，細(xì)胞自身分泌或人為在培養(yǎng)基中加入貼附因子，使細(xì)胞依附在支持物表面，才能生長(zhǎng)和增殖，大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞都屬于此類非貼壁依賴性細(xì)胞：生長(zhǎng)不依賴于固體支持物表面，可在培養(yǎng)液中懸浮生長(zhǎng)，有時(shí)被稱為懸浮細(xì)胞血液、淋巴細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞和某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞屬于此類，生長(zhǎng)干擾素的Namalwa細(xì)胞有些細(xì)胞對(duì)支持物的依賴性不嚴(yán)格，可貼壁生長(zhǎng)，可懸浮生長(zhǎng)中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞、小鼠L929細(xì)胞、BHK細(xì)胞?,根據(jù)細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)特性和對(duì)基質(zhì)的依賴性，可分為貼壁依賴性細(xì)胞和非,69,二、工程細(xì)胞的獲得與保存,目前用于制藥的動(dòng)物細(xì)胞有4類，即原代細(xì)胞系、二倍體細(xì)胞系、異倍體細(xì)胞系和融合的或重組的工程細(xì)胞系。

細(xì)胞無(wú)限傳代，使大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)藥物成為可能異倍體細(xì)胞用于產(chǎn)生重組基因工程產(chǎn)品，使動(dòng)物細(xì)胞成為藥物生產(chǎn)的一個(gè)新領(lǐng)域?,二、工程細(xì)胞的獲得與保存?,70,1. 原代細(xì)胞系的分離與培養(yǎng),用原代細(xì)胞系生產(chǎn)藥物需要大量的動(dòng)物動(dòng)物組織或器官,洗滌 粉碎,酶解消化,離心或過(guò)濾,接種培養(yǎng),培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞,洗 滌,37度消化，檢查是否充分和完全胰蛋白酶：細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織，胚胎、肝、腎及傳代細(xì)胞,膠原酶：纖維、上皮、癌組織,工作濃度：0.1-0.3 mg/ml,鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶,,?,1. 原代細(xì)胞系的分離與培養(yǎng)動(dòng)物組織或器官洗滌 粉碎酶解消化,71,2. 傳代細(xì)胞培養(yǎng),長(zhǎng)滿器皿表面的細(xì)胞進(jìn)行分離，接種到新的培養(yǎng)基上，進(jìn)行新一輪培養(yǎng)掌握好最佳時(shí)期：剛剛?cè)繀R合的細(xì)胞，過(guò)早產(chǎn)量低，過(guò)晚健康狀態(tài)不佳過(guò)程與原代細(xì)胞相同，用30－50倍體的0.25％胰蛋白酶和EDTA對(duì)細(xì)胞塊消化，消化后再培養(yǎng)要注意消化程度，細(xì)胞對(duì)酶的反應(yīng)不同，有的敏感，掌握好適宜的消化時(shí)間和方法，不要過(guò)度，獲得細(xì)胞濃度均勻，生長(zhǎng)速度一致的傳代細(xì)胞曾經(jīng)廣泛應(yīng)用，但不是理想的生產(chǎn)細(xì)胞系,,?,2. 傳代細(xì)胞培養(yǎng)?,72,3. 細(xì)胞系的建立與保存,一旦獲得了穩(wěn)定的有一定特性的細(xì)胞系，就建立細(xì)胞庫(kù)，進(jìn)行長(zhǎng)期保存。

根據(jù)藥品生產(chǎn)的有關(guān)規(guī)定，必須建立原始細(xì)胞庫(kù)和生產(chǎn)用細(xì)胞庫(kù)或工作細(xì)胞庫(kù)WCB1,QC,,WCB2,QC,QC,原始培養(yǎng)物,MCB,,QC內(nèi)容：細(xì)胞活性檢測(cè)、無(wú)菌實(shí)驗(yàn)、核型、,DNA,分析、同工酶分析、支原體試驗(yàn)、其他外源物試驗(yàn)、穩(wěn)定性和基因型分析等，工作細(xì)胞庫(kù)必須與主細(xì)胞庫(kù)完全一致?,3. 細(xì)胞系的建立與保存WCB1QCWCB2QCQC原始培養(yǎng),73,低溫冷凍保存：,用冷凍保護(hù)液（含10％血清的培養(yǎng)液，附加10％甘油或7.5%-10%二甲基亞砜）細(xì)胞預(yù)冷，稀釋成10,6,細(xì)胞/ml分裝，火焰下封口緩慢冷凍，細(xì)胞放入CO,2,低溫冰柜或液氮中，溫度為-150—-190,℃,，細(xì)胞的全部活動(dòng)幾乎處于停止?fàn)顟B(tài)復(fù)蘇細(xì)胞：,冷凍細(xì)胞取出，立即在37,℃,水浴中，快速融化在保護(hù)劑存在下，慢凍快融是保存復(fù)蘇細(xì)胞的要領(lǐng)融化后的細(xì)胞可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)?,低溫冷凍保存：?,74,三、大規(guī)模培養(yǎng)方法,根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)，只能采用懸浮培養(yǎng)、貼壁培養(yǎng)、固定化培養(yǎng)等三種主要方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)1. 單層貼壁培養(yǎng),細(xì)胞貼附于一定的固體支持表面上，進(jìn)行的培養(yǎng)方法大多數(shù)動(dòng)物細(xì)胞屬于貼壁依賴性，貼壁培養(yǎng)是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的一種重要方法。

接種后，細(xì)胞經(jīng)過(guò)吸附、接觸而,貼附于基質(zhì)表面，然后進(jìn)行,生長(zhǎng)、分裂繁殖，很快進(jìn)入對(duì)數(shù)期一般數(shù)天就長(zhǎng)滿整個(gè)表面，形成致密的單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)容器:轉(zhuǎn)瓶、玻璃珠、微載體和中空纖維等滾瓶是為早期培養(yǎng)所采用，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，投資少，重復(fù)性好，但勞動(dòng)強(qiáng)度大，占用空間大，產(chǎn)量低，不易控制和監(jiān)測(cè)?,三、大規(guī)模培養(yǎng)方法?,75,細(xì)胞貼壁原理：,細(xì)胞主要靠靜電引力和范德華力貼附在固體表面，因?yàn)閯?dòng)物細(xì)胞在生理狀態(tài)下帶負(fù)電，貼壁培養(yǎng)的固體表面要求具有正電荷和高表面活性適宜的電荷密度是粘附和貼壁的關(guān)鍵，電荷密度低，不能有效粘附，電荷密度高則會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性優(yōu)點(diǎn)：容易更換培養(yǎng)液，灌注培養(yǎng)時(shí)，能達(dá)到高細(xì)胞密度；有利于產(chǎn)物的分泌表達(dá)，可改變培養(yǎng)液與細(xì)胞的比例缺點(diǎn)：操作較煩雜，檢測(cè)受到一定限制，培養(yǎng)條件難以均一，傳質(zhì)和傳氧差，放大培養(yǎng)是瓶頸?,細(xì)胞貼壁原理：?,76,2．微載體培養(yǎng),微載體為三維培養(yǎng)系統(tǒng)，細(xì)胞貼附于微載體上伸展和增殖，再懸浮于培養(yǎng)液中微載體培養(yǎng)兼具貼壁和懸浮培養(yǎng)的雙重優(yōu)點(diǎn)，有很大的比表面積，供單層細(xì)胞貼附和增殖懸浮微球使細(xì)胞生長(zhǎng)的環(huán)境均一，培養(yǎng)基利用率高，重復(fù)性好，減少了勞動(dòng)強(qiáng)度，容易放大，于20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)干擾素、疫苗和尿激酶原等。

多孔微載體或多孔微球，極大地增加了比表面積，如Cytodex-1的比表面積達(dá)6000 cm,2,/g，Cytopore的比表面積達(dá)28000 cm,2,/g商品化的微載體基質(zhì)有玻璃、葡聚糖、纖維素、塑料和明膠等，表面帶電基團(tuán)為DEAE等?,2．微載體培養(yǎng)?,77,玻璃珠：直徑約,2,～,3 μm,，密度,1.5 g/cm,3,，難以在低速下懸浮在玻璃表面覆蓋塑料，可得到低密度微載體，如,Bioglas,和,Ventreglas,，而中空玻璃也可達(dá)到此密度葡聚糖微載體：帶正電，干粉可在,pH7.2,的磷酸鹽緩沖液中吸脹，清洗滅菌后使用Cytodex 2：,電荷性大大下降，吸附能力很低，適合于蛋白質(zhì)藥物的生產(chǎn)纖維素微載體,DE52,和,DE53：,適合多種細(xì)胞培養(yǎng)塑料載體,Biosilon,是聚乙烯載體，無(wú)吸附性能，可重復(fù)使用，但貼壁較慢，對(duì)細(xì)胞的摩擦損傷較大聚丙烯酰胺載體貼壁較快，親水性?,玻璃珠：直徑約2～3 μm，密度1.5 g/cm3，難以在低,78,微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過(guò)程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和氣升式反應(yīng)器等為了提高貼壁能力，對(duì)基質(zhì)表面進(jìn)行包埋，如血清蛋白、多聚賴氨酸處理，可加速貼壁過(guò)程。

在懸浮培養(yǎng)早期，還可向培養(yǎng)液補(bǔ)充丙酮酸、腺嘌呤、次黃嘌呤、胸腺嘧啶等?,微載體的選擇依賴于攪拌系統(tǒng)和工藝過(guò)程，可用于轉(zhuǎn)瓶、攪拌燒瓶和,79,多孔微載體：,直徑,0.2,～,5 mm,，孔徑,20,～,300 μm,，達(dá)占總體積的,85%,，可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的固定化，達(dá)到高密度培養(yǎng)廣泛使用的多孔微載體有,Cellsnow,、,Cytocell,（纖維素基質(zhì)）、,Verax,、,Cultisphere,（膠原）、,Cytoline 1,和,2,（聚苯乙烯）、,ImmobaSil,（硅橡膠）及,Siran,（玻璃）等主要用于攪拌反應(yīng)器、固定床和流化床反應(yīng)器?,多孔微載體：?,80,貼壁培養(yǎng)的固體表面要求：,正電荷和高度表面活性玻璃、聚苯乙烯塑料、不銹鋼金屬材料和微載體、,多孔微載體或多孔微球商品化的微球基質(zhì)是葡聚糖、聚丙烯酰胺、明膠交聯(lián)、聚苯乙烯和纖維素等，帶電基團(tuán)為DEAE等微載體有CytodexI、II、III和 DEAE－纖維素等，已是主要的培養(yǎng)方法理想的微載體所具備的性能：,質(zhì)地柔軟，微球間摩擦輕；耐高溫，可高壓滅菌；透明性，便于觀察細(xì)胞生長(zhǎng)；細(xì)胞相容性，利于貼附和生長(zhǎng)；無(wú)毒性和惰性，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害，不產(chǎn)生有害物質(zhì)，不吸附培養(yǎng)基；低速即懸浮，靜止即沉降，便于換液和收獲；微粒大小均勻；可回收重復(fù)使用。

?,貼壁培養(yǎng)的固體表面要求：?,81,3. 懸浮培養(yǎng),細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)游離懸浮生長(zhǎng)的培養(yǎng)過(guò)程,主要對(duì)于非貼壁性依賴性細(xì)胞，如雜交瘤細(xì)胞等動(dòng)物細(xì)胞懸浮培。