基因工程制藥培訓(xùn)

Click to edit Master title style,,Click to edit Master text styles,,Second level,,Third level,,Fourth level,,Fifth level,,*,,*,單擊此處編輯母版標(biāo)題樣式,,單擊此處編輯母版文本樣式,,第二級,,第三級,,第四級,,第五級,,*,,*,基因工程,制藥簡介,張,義浜,,2017-05-20,概述,目的基因的獲得,基因的表達(dá),基因工程菌的,培養(yǎng),基因工程藥物的分離純化,傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題,:,1.,材料來源或制造技術(shù)困難而無法研制出產(chǎn)品；,,2.,從動物臟器中提取,易感染病毒；,,3.,存在免疫原性，使用受限制基因工程制藥的優(yōu)點,大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽,提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì),發(fā)現(xiàn)更多,的內(nèi)源性生理活性物質(zhì),利用基因工程和蛋白質(zhì)工程對生理活性物質(zhì)進(jìn)行修飾和改造，提高藥效價值,獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選來源,基因工程技術(shù)所生產(chǎn)的藥物,,用傳統(tǒng)方法很難生產(chǎn)的，主要是藥用活性蛋白質(zhì),/,多肽，包括：,（,1,）免疫相關(guān)蛋白,----,各種抗原、單克隆抗體。

2,）細(xì)胞因子,----,如,IFN,、,IL,、,CSF,、,EGF,、,VIII,、,EPO,（,3,）激素,----,胰島素、生長激素、心鈉素、人腦激素、人松馳激素4,）酶類,----,尿激酶、鏈激酶、葡聚糖酶、組織型纖維蛋白溶解酶原激活劑、,SOD,、,a-,淀粉酶、凝乳酶、人溶菌酶、胰蛋白酶抑制劑早期部分基因工程產(chǎn)品的研制、開發(fā)、上市時間,產(chǎn)品,研制,國家,用途,上市,國家,人生長激素釋放抑制素,(SRM),1977,日本,巨人癥,,,人胰島素,1978,美國,糖尿病,1982,歐洲,人生長激素（,HGH,）,1979,美國,侏儒癥,1985,美國,人,α,-,干擾素（,IFN,）,1980,美國,病毒,1985,歐洲,乙肝疫苗,1983,美國,乙肝,1986,歐洲,人白細(xì)胞介素（,IL,）,1984,美國,腫瘤,1989,歐洲,人促紅細(xì)胞生成素（,EPO,）,,日本,貧血,1988,歐洲,人粒細(xì)胞集落刺激因子,(G-CSF),,,白血病,1991,美國,人組織纖溶酶原激活劑（,t-PA,）,,,血栓癥,1987,美國,我國批準(zhǔn)上市的部分生物技術(shù)藥物,批準(zhǔn)年份,藥品,批準(zhǔn)年份,藥品,1989,IFN-α1b,1999,125Ala IL-2,、人胰島素、,Anti-CD3,鼠源單抗,1992,IFN-α2a,2000,人堿性成纖維細(xì)胞生長因子（,bFGF,）,,表皮生長因子（,EGF,）、,EGF,衍生物,,霍亂疫苗（,rBS-WC,）,1994,白介素,2,（,IL-2,）,2001,抗,IL-8,鼠源單抗凝乳劑,1995,乙肝疫苗（酵母）,2003,IL-11,、腫瘤細(xì)胞細(xì)胞核嵌合抗體注射液重組葡激酶（,r-SAK,）,1996,IFN-α 2b,，,,乙肝疫苗（,CHO,）,,粒細(xì)胞集落刺激因子（,G-CSF,）,2004,重組人,p53,腺病毒注射液,,抗,EGFR,人源單抗,1997,粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（,GM-CSF,）,,重組鏈激酶（,γ-SK,）、,EPO,2005,重組人腦利鈉肽、重組人血管內(nèi)皮抑素,,重組人,5,型腺病毒注射液（,H101,）、,rhTNF-α,、,rhTPO,1998,IFN-γ,、,125Ser IL-2,、生長激素（,GH,）,,痢疾疫苗、,,牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子（,bFGF,）,2006,重組,TNFR-Fc,融合蛋白,,什么是基因工程技術(shù)？,基因工程（,genetic engineering,）：也稱基因操作、遺傳工程，重組體,DNA,技術(shù)，基因克隆或分子克隆，指將不同生物的遺傳物質(zhì),——,基因，在體外進(jìn)行剪切、組合和拼接，使遺傳物質(zhì)重新組合，然后通過載體（質(zhì)粒、噬菌體或病毒等）轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)行無性繁殖，并使所需要的基因在細(xì)胞中表達(dá)，產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)物或組建成新的生物類型。

制備基因工程藥物的基本過程,,獲得目的基因 ↓ 構(gòu)建重組質(zhì)粒 ↓組建基因工程菌,(,或細(xì)胞,) ↓,培養(yǎng)工程菌 ↓ 產(chǎn)物分離純化 ↓ 除菌過濾 ↓ 半成品檢定 ↓ 成品檢定 ↓ 包裝,,上游階段,選擇表達(dá)系統(tǒng)主要考慮：,必須保證所表達(dá)的蛋白質(zhì)具有生物活性,考慮基因工程蛋白質(zhì)表達(dá)量的多少,蛋白質(zhì)分離純化的難易程度,,下游階段,基因的,克隆,工 具 酶,功 能,限制性核酸內(nèi)切酶,識別特異序列，切割,DNA,DNA,連接酶,催化,DNA,中相鄰的,5′,磷酸基和,3′,羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使,DNA,切口封合或使兩個,DNA,分子或片段連接,DNA,聚合酶,Ⅰ,合成雙鏈,cDNA,分子或片段連接,,缺口平移制作高比活探針,,DNA,序列分析,,填補,3′,末端,Klenow,片段,又名,DNA,聚合酶,I,大片段，具有完整,DNA,聚合酶,I,的,5,??,3,?,聚合、,3??,5,?,外切活性，而無,5??,3,?,外切活性。

常用于,cDNA,第二鏈合成，雙鏈,DNA 3?,末端標(biāo)記等,反轉(zhuǎn)錄酶,合成,cDNA,,替代,DNA,聚合酶,I,進(jìn)行填補，標(biāo)記或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸,5′,羥基末端磷酸化，或標(biāo)記探針,末端轉(zhuǎn)移酶,在,3′,羥基末端進(jìn)行同質(zhì)多聚物加尾,堿性磷酸酶,切除末端磷酸基,目的基因的獲得,一、反轉(zhuǎn)錄法,二、反轉(zhuǎn)錄,PCR,三、化學(xué)合成法,,常用的方法,:,一、反轉(zhuǎn)錄法,為了克隆編碼某種特異蛋白質(zhì),多肽的,DNA,序列，可以從產(chǎn)生該蛋,白質(zhì)的真核細(xì)胞中提取,mRNA,,以,其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，,反轉(zhuǎn)錄生成該蛋白質(zhì),mRNA,互補,DNA,（,cDNA,第一鏈），再以,cDNA,第一鏈為模板，在,DNA,聚合酶,Ⅰ,作,用下，最終合成編碼該多肽的雙鏈,DNA,序列cDNA,克隆示意圖,DNA,聚合酶,I,mRNA,,,,,反轉(zhuǎn)錄酶,ss-DNA,,,,,,,,,ds-cDNA,,,ds-cDNA,核酸酶,S1,,二、反轉(zhuǎn)錄,PCR,,提取組織或細(xì)胞中的總,RNA,，以其中的,mRNA,作為模,板，采用,Oligo(dT),或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成,cDNA,第一,鏈，直接以其為,模板（不需要合成,cDNA,第二鏈）進(jìn)行,PCR,擴(kuò)增,，獲得,目的基因，用于重組、克隆。

三、化學(xué)合成法,前提：核苷酸,序列已知；,或已知其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列,限制性：,,1,）不能,直接,合成太長的基因,；,,2,）遺傳密碼的簡并性可導(dǎo)致中性突變；,,3,）,成本,較高,DNA,合成儀,基因,的克隆與表達(dá),基因表達(dá)：,基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄、翻譯及所有加工過程基因高效表達(dá)：外源基因在某種宿主細(xì)胞中的表達(dá)活動，即剪切下一個外源基因片段，重組到另一個基因表達(dá)體系中，使其能獲得既有原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物基因表達(dá)研究的主要問題：目的基因的表達(dá)產(chǎn)量、表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性、產(chǎn)物的生物學(xué)活性和表達(dá)產(chǎn)物的分離純化建立最佳的基因表達(dá)體系，是基因表達(dá)設(shè)計的關(guān)鍵,一、宿主菌的選擇,,宿主菌應(yīng)滿足以下要求：,,具有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率；,,能利用易得廉價原料；,,不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素；,,發(fā)熱量低，需氧低，適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度和細(xì)胞形態(tài)；,,容易進(jìn)行代謝調(diào)控；,,方便重組,DNA,操作；,,產(chǎn)物容易提取純化1.,原核細(xì)胞,（,1,）大腸桿菌,表達(dá)產(chǎn)物的形式：細(xì)胞內(nèi)不溶性表達(dá),(,包涵體,),、胞內(nèi)可溶性表達(dá)、細(xì)胞周質(zhì)表達(dá)，極少數(shù)情況下也可分泌到細(xì)胞外不同的表達(dá)形式具有不同的表達(dá)水平及完全不同的雜質(zhì)。

大腸桿菌表達(dá),外源基因的優(yōu)勢,全基因組測序，遺傳背景清楚（共,4405,,ORF,）,,基因克隆表達(dá)系統(tǒng)成熟完善,,繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、操作方便、遺傳穩(wěn)定,,被美國,FDA,批準(zhǔn)為安全的基因工程受體生物,,缺陷,缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的復(fù)性功能,缺乏對真核生物蛋白質(zhì)的修飾加工系統(tǒng),內(nèi)源性蛋白酶降解空間構(gòu)象不正確的異源蛋白,細(xì)胞周質(zhì)內(nèi)含有種類繁多的內(nèi)毒素,（,2,）枯草芽孢桿菌,分泌能力強，可將蛋白質(zhì)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，不形成,包涵體,；不能使蛋白質(zhì)糖基化，另外由于它有很強的胞外蛋白酶，會對產(chǎn)物進(jìn)行不同程度的,降解,（,3,）鏈霉菌,重要的工業(yè)微生物不致病、使用安全，分泌能力強，可將表達(dá)產(chǎn)物直接分泌到培養(yǎng)液中，具有一定的糖,基化,能力,2,、真核細(xì)胞,,（,1,）酵母,,特點：,,真核生物細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)物能糖基化；,,基因組小，僅為大腸桿菌的,4,倍；,,世代時間短，繁殖迅速；,,基因操作與原核生物相似；,,建立了有分泌功能的表達(dá)系統(tǒng)，將產(chǎn)物分泌出胞外，分離純化工藝相對簡單2,）絲狀真菌,,特點：,,有很強的蛋白分泌能力；,,能正確進(jìn)行翻譯后加工，包括肽剪切和糖基化等,;,,其糖基化方式與高等真核生物相似；,,絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝。

真核生物和原核生物,基因表達(dá),過程示意圖,克隆,載體,:,克隆,了外源,DNA,后，轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行繁殖，,使克隆,的,DNA,片段數(shù)量大大增加,表達(dá),載體,:,將外源基因或,DNA,片段在宿主細(xì)胞中表達(dá),蛋白質(zhì),插入型載體,:,將外源基因或,DNA,插入其中,置換型載體,:,切除,載體部分,DNA,，代之以外源基因或,DNA,載體（,vector,）,質(zhì)粒（,plasmid,）,質(zhì)粒是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主細(xì)胞染色體外而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子,絕大多數(shù),質(zhì)粒是,DNA,型的，天然,DNA,質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即,cccDNA,基因克隆的載體質(zhì)粒,DNA,分子都具有復(fù)制子、選擇性標(biāo)記、克隆位點,原核細(xì)胞,表達(dá)載體,非融合型,pKK223-3,,分泌型,PINⅢ-ompA1,,融合蛋白表達(dá)載體,pGEX,結(jié)構(gòu),包涵體型,pBV220,結(jié)構(gòu),,融合蛋白表達(dá)載體,非融合型表達(dá)載體,分泌型表達(dá)載體,包涵體型表達(dá)載體,（一）表達(dá)載體,表達(dá)載體必須具備的條件：,載體能夠獨立的復(fù)制；,具有靈活的克隆位點和方便的篩選標(biāo)記,,,且克隆位點應(yīng)在啟動子序列后，以便外源基因表達(dá)；,具有很強的啟動子，能為大腸桿菌的,RNA,聚合酶識別；,具有阻遏子，使啟動子受到控制，只有當(dāng)誘導(dǎo)時才能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄；,具有很強的終止子，使,RNA,聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因，而不轉(zhuǎn)錄無關(guān)的基因；,所產(chǎn)生的,mRNA,必須具有翻譯的起始信號，即起始密碼,AUG,和,SD,序列，以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯。

二）影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素,外源基因的劑量,外源基因的表達(dá)效率：,,A,、啟動子的強弱：將目的基因插入大腸桿菌,RNA,聚合酶能識別的強啟動子下游,,B,、核糖體結(jié)合位點的有效性,,C,、,SD,序列和起始密碼的間距,,D,、密碼子組成：設(shè)計引物或合成基因時選擇大腸桿菌“偏愛”的密碼子,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性：,,A,、組建融合蛋白；,,B,、利用信號肽將真核基因產(chǎn)物搬至周質(zhì)空隙中；,,C,、位點特異性突變，增加蛋白的穩(wěn)定性；,,D,、采用蛋白酶缺陷型大腸桿菌，減弱降解作用,細(xì)胞的代謝負(fù)荷：,,A,、宿主細(xì)胞的生長與外源基因的表達(dá)分開；,,B,、宿主細(xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開；,,C,、形成不溶性的包涵體,工程菌的培養(yǎng)條件,（三）真核基因在大腸桿菌中表達(dá)的形式,1.,以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因,其氨基端是原核序列，羧基端是真核序列，以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起，稱融合蛋白優(yōu)點：操作簡便，表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定，不易被,細(xì)菌酶類降解；易實現(xiàn)高效表達(dá)；,缺點：有免疫原性，需切除原核多肽,2.,以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因,,非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的,mRNA,的,AUG,為起始，在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列。

優(yōu)點：保持原有蛋白活性；,,缺點：易被蛋白酶破壞；可能引起人體免疫反應(yīng),3.,分泌型表達(dá)蛋白藥物基因,,將外源基因融合到編碼信號肽序列的下游常用的信號肽有：堿性磷酸酶信號肽；膜外周質(zhì)蛋白,,信號肽；霍亂弧菌毒素,B,亞單位；,,優(yōu)點：在周質(zhì)中穩(wěn)定，有活性，不含甲硫氨酸殘基；,,缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切割酵母中,的基因表達(dá),（一）表達(dá)載體,1.,載體的復(fù)制序列,（,1,）,YEp,類（酵母附加體質(zhì)粒）,（,2,）,YRp,類（酵母復(fù)制型質(zhì)粒）,（,3,）,YCp,類（酵母著絲粒質(zhì)粒）,（,4,）,YIp,類（,酵母整合型質(zhì)粒）,2.,克隆載體,,向酵母載體中引入大腸桿菌質(zhì)粒,pBR322,的,ori,部,,分和,Amp,r,或,Tet,r,部分，這樣構(gòu)成的克隆載體同時帶,,有細(xì)菌和酵母的復(fù)制原點和選擇標(biāo)記酵母常用的選擇性標(biāo)記：氨基酸或核苷酸合成酶,,系基因，對抑制酵母生長的藥物具有抵抗力的抗性,,基因,,3.,表達(dá)載體,,普通表達(dá)載體：只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表,,達(dá)，對表達(dá)產(chǎn)物的組成，特別是對其,N,末端氨基酸,,是否增減并無嚴(yán)格要求精確表達(dá)載體：要求在啟動子或前導(dǎo)肽編碼序列的,,適當(dāng)部位有內(nèi)切酶位點，以利于接入外源基因，并,,使它在表達(dá)和加工后,N,末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物,,相同，既無多余的氨基酸，也無缺失的氨基酸。

二）影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素,,1.,外源基因的劑量：質(zhì)?？截悢?shù)及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性,,2.,外源基因的表達(dá)效率：,,,A,、啟動子,,,B,、分泌信號的效率,,,C,、終止序列的影響,3.,外源蛋白的糖基化,,4.,宿主菌株的影響：,,,A,、菌體生長力強；,,,B,、菌體內(nèi)源蛋白酶要弱；,,,C,、菌株性能穩(wěn)定；,,,D,、分泌能力強,基因工程菌的培養(yǎng),基因工程菌發(fā)酵的基本操作方式有：,,分批培養(yǎng),分批培養(yǎng)操作簡單，但因不能控制生長，獲得的菌體密度也有限,,半連續(xù)培養(yǎng)（補料分批）,在,一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，流加一定量的營養(yǎng)，使細(xì)胞進(jìn)一步的,生長,，或得到更多的代謝產(chǎn)物,連續(xù)培養(yǎng),不斷地流加營養(yǎng)，并不斷地取出發(fā)酵液連續(xù)培養(yǎng)則多用于動力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究透析培養(yǎng),,固定化培養(yǎng),基因工程菌培養(yǎng)方式,補料分批培養(yǎng),補料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間，間歇或連續(xù)地補加新鮮培養(yǎng)基，使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法在分批培養(yǎng)中，為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境，延長其生長對數(shù)期，獲得高密度菌體，通常把溶氧控制和流加補料措施結(jié)合起來，根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補料的流加速率。

連續(xù)培養(yǎng),連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中，攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后，開動進(jìn)料和出料蠕動泵，以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)可以為微生物提供恒定的生活環(huán)境，控制其比生長速率，為研究基因工程菌的發(fā)酵動力學(xué)、生理生化特性、環(huán)境因素對基因表達(dá)的影響等創(chuàng)造了良好的條件但由于基因工程菌的不穩(wěn)定性，連續(xù)培養(yǎng)比較困難為了解決這一問題，人們將工程菌的生長階段和基因表達(dá)階段分開，進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng)在這樣的系統(tǒng)中關(guān)鍵的控制參數(shù)是誘導(dǎo)水平、稀釋率和細(xì)胞比生長速率優(yōu)化這三個參數(shù)以保證在第一階段培養(yǎng)時質(zhì)粒穩(wěn)定，菌體進(jìn)入第二階段后可獲得最高表達(dá)水平或最大產(chǎn)率透析培養(yǎng),透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離，其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響采用膜透析裝置是在發(fā)酵過程中用蠕動泵將發(fā)酵液抽出打入罐外的膜透析器的一側(cè)循環(huán)，其另一側(cè)通入透析液循環(huán)，在補料分批培養(yǎng)中，大量乙酸在透析器中透過半透膜，降低培養(yǎng)基中的乙酸濃度，并可通過在透析液中補充養(yǎng)分而維持較合適的基質(zhì)濃度，從而獲得高密度菌體膜的種類、孔徑、面積，發(fā)酵液和透析液的比例，透析液的組成，循環(huán)流速，開始透析的時間和透析培養(yǎng)的持續(xù)時間段都對產(chǎn)物的產(chǎn)率有影響,固定化培養(yǎng),基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。

有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高，便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，特別是對分泌型菌更為有利由于這一優(yōu)點，基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展基因工程菌發(fā)酵中試,,基因工程菌中試應(yīng)考慮的問題：適宜商品化生產(chǎn)的工程菌，設(shè)計發(fā)酵反應(yīng)器，選擇反應(yīng)過程，發(fā)酵培養(yǎng)基組分，維持生產(chǎn)工藝最佳化的方法，工藝監(jiān)測方法，工藝控制方法，工藝自動化使用方法，生物催化劑使用，產(chǎn)品提取方法的選擇，分離精制技術(shù)的選擇基因工程菌的不穩(wěn)定性,主要,表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性，,兩種,表現(xiàn)形式：,,1,）,結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性,,重組,DNA,分子上某一區(qū)域發(fā)生缺失、重排、修飾，導(dǎo)致其表觀生物學(xué)功能的喪失,,2,）,分配不穩(wěn)定性,,整個,重組,DNA,分子從受體細(xì)胞中逃逸,基因工程菌不穩(wěn)定性的可能產(chǎn)生機(jī)制：,受體細(xì)胞,中限制修飾系統(tǒng)對外源重組,DNA,分子的降解,外源基因的高效表達(dá)嚴(yán)重干擾受體細(xì)胞,正常生長代謝,,,能量、,物質(zhì)的匱乏和外源基因表達(dá)產(chǎn)物的毒性誘導(dǎo)受體細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)：關(guān)閉合成途徑，啟動降解程序,重組質(zhì)粒在受體細(xì)胞分裂時的不均勻,分配,重組質(zhì)粒,逃逸的基本原因,受體細(xì)胞中內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件促進(jìn)重組分子的缺失重排,培養(yǎng)基,比生長速率,限制性基質(zhì),溫度,pH,和溶氧,外源基因,表達(dá),,,遺傳特性,,影響基因工程菌穩(wěn)定性的因素,載體的選擇,宿主的選擇,外源基因整合到宿主染色體上,發(fā)酵工藝,1.,培養(yǎng)基,一些基因重組菌在復(fù)合培養(yǎng)基中顯示較高的質(zhì)粒穩(wěn)定性,微生物在含有有機(jī)氮源如酵母抽提物、蛋白胨等營養(yǎng)豐富的復(fù)合培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，由于培養(yǎng)基提供了生長必須的氨基酸和其他物質(zhì)，微生物的生長較基本培養(yǎng)基快。

培養(yǎng)條件對,基因工程菌,穩(wěn)定性的影響,2.,比生長速率,基因重組菌的比生長速率對質(zhì)粒穩(wěn)定性有很大影響提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性基因重組菌的比生長速率與培養(yǎng)環(huán)境有關(guān)，如溫度，,pH,，溶氧，限制性營養(yǎng)物質(zhì)濃度，有害代謝產(chǎn)物濃度等在一定的溫度和,pH,下，限制性基質(zhì)濃度往往是決定比生長速率的主要因素3.,限制性基質(zhì),一般培養(yǎng)基中各成分并不是完全平衡的，經(jīng)過一段時間的培養(yǎng)，微生物的生長通常會受到一種或幾種物質(zhì)的限制限制性基質(zhì)的種類對重組菌有不同的影響,4. pH,和溶解氧,pH,和,溶氧是影響微生物生長的重要參數(shù)，在發(fā)酵罐培養(yǎng)基因重組菌時，通常都需要維持一定的,pH,和溶氧水平在基因重組菌的高密度培養(yǎng)時，為了維持所需的溶氧水平，除了提高攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量，往往還要在通入的空氣中補充氧氣，以提高發(fā)酵罐的供氧能力5.,外源基因的表達(dá),外源基因的表達(dá)會引起重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定；尤其當(dāng)外源基因高效表達(dá)時，有可能因競爭利用物質(zhì)、能量、核糖體等干擾宿主細(xì)胞的正常代謝活動，并造成質(zhì)粒不穩(wěn)定例如，吲哚丙烯酸（,IAA,）是,trp,,操縱子阻遏物的部分去阻遏劑，在培養(yǎng)大腸桿菌,MV12,（,pVH5,）時，在培養(yǎng)基中加入不同量的,IAA,，發(fā)現(xiàn)隨,IAA,量的增加，,pVH5,帶有的分支酸合成酶和色氨酸合成酶基因的表達(dá)水平有很大提高，同時比生長速率下降，培養(yǎng)液中,Trp,－,,的比例上升。

電泳分析表明,60%,～,70%,色氨酸合成能力喪失是由于質(zhì)粒結(jié)構(gòu)的變化，其余是由于質(zhì)粒丟失造成1,、改進(jìn),載體受體系統(tǒng),,以,增加質(zhì)粒穩(wěn)定性為目的的構(gòu)建方法包括：,,1,）將,R1,質(zhì)粒上的,parB,,基因引入表達(dá)型載體中，其表達(dá)產(chǎn)物可以選擇性地殺死由于分配不均勻所產(chǎn)生的無質(zhì)粒細(xì)胞,,2,）正確設(shè)置載體上的多克隆位點，禁止,DNA,片段插在穩(wěn)定區(qū)內(nèi),,3,）將受體細(xì)胞的致死性基因安裝在載體上，同時構(gòu)建條件致死性的相應(yīng)受體系統(tǒng)，如大腸桿菌的,ssb,,基因（,DNA,單鏈結(jié)合蛋白編碼基因）,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,2,、施加,選擇壓力,根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素,藥物和食品生產(chǎn)時禁止使用抗生素；加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加；添加一些容易被水解失活的抗生素，只能維持一定時間；添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力,載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份,培養(yǎng)基復(fù)雜，成本較高,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,3,、分,階段控制培養(yǎng),因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時，可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制,在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài)，避免因表達(dá)造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生；在獲得需要的菌體密度后，再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達(dá)。

連續(xù)培養(yǎng)時可以考慮采用多級培養(yǎng)，如在第一級進(jìn)行生長，維持菌體的穩(wěn)定性，在第二級進(jìn)行表達(dá)提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,4,、控制目的基因的過量表達(dá),使用可控型啟動子控制目的基因的定時表達(dá)及表達(dá)程度,使用可控型復(fù)制子控制質(zhì)粒的定時增殖或降低質(zhì)粒的拷貝數(shù),,5,、優(yōu)化,基因工程菌的培養(yǎng)工藝,培養(yǎng)基組成：限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定,培養(yǎng)溫度：較低,的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的,穩(wěn)定,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,6,、控制培養(yǎng)條件,有些,含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢，因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率，從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性例如,研究表達(dá)干擾素的,大腸桿菌,W3110(pEC901),在不同比生長速率下的質(zhì)粒穩(wěn)定性，隨著稀釋率的增加，質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加，干擾素的比效價也明顯增大,.,,提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,7,、固定化,培養(yǎng),固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性,基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后，質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達(dá)率都有了很大提高 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素，氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段，往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用。

而采用固定化方法后，這種選擇壓力則可被省去不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性提高基因工程菌穩(wěn)定性的策略,基因工程藥物的分離純化,目的產(chǎn)物在初始物料中的含量較低；,含目的產(chǎn)物的初始物料組成復(fù)雜，除目的產(chǎn)物外，還有大量的細(xì)胞、代謝物、殘留培養(yǎng)基、無機(jī)鹽等，特別是產(chǎn)物類似物對目的產(chǎn)物的分離純化影響很大；,目的產(chǎn)物的穩(wěn)定性差，具有生物活性的物質(zhì)對,pH,、溫度、金屬離子、有機(jī)溶劑、剪切力、表面張力等十分敏感，容易失活、變性；,種類繁多，包括大、中、小分子、結(jié)構(gòu)簡單或復(fù)雜的有機(jī)化合物，以及結(jié)構(gòu)和性質(zhì)復(fù)雜又各異的生物活性物質(zhì)；,應(yīng)用面廣，對其質(zhì)量、純度要求高，甚至要求無菌、無熱原基因工程藥物或生物技術(shù)產(chǎn)品特點,一、建立分離純化工藝需了解的各種因素,1.,含目的產(chǎn)物的初始物料的特點,（,1,）菌種,類型及其代謝特性,（,2,）原材料和培養(yǎng)基的來源及質(zhì)量是否穩(wěn)定,（,3,）生產(chǎn)工藝和條件,（,4,）初始,物料的物理、化學(xué)和生物學(xué)特性,2.,物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì),3.,目的產(chǎn)物特性,4.,產(chǎn)品質(zhì)量的要求,二、分離純化的基本過程,,基因工程藥物的分離純化主要分為,5,個步驟，,,包括細(xì)胞破碎、固液分離、濃縮與初步純化、高度,,純化直至得到純品，以及成品加工。

分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)色譜技術(shù)分為：,,離子交換色譜,,,親和色譜,,凝膠過濾色譜,,高效液相色譜等,三、重組蛋白質(zhì)的分離純化,產(chǎn)物的主要特性及在分離純化中的作用,基因工程藥物生產(chǎn)中常用的分離純化方法,基因工程藥物制造實例,干擾素是真核細(xì)胞對各種刺激作出反應(yīng)而自然形成的一組復(fù)雜的蛋白質(zhì)干擾素除具有廣譜抗病毒活性，還具有抑制細(xì)胞分裂，特別是抑制腫瘤細(xì)胞生長和免疫調(diào)節(jié)等功能，作為一種生物活性蛋白有著良好的臨床應(yīng)用價值干擾素在我國已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物早期獲得方法：用病毒誘導(dǎo)人白血球,(,白細(xì)胞,),產(chǎn)生，產(chǎn)量低，價格貴300L,人血才提取,1mg,,（一）干擾素,2003,年抗非典期間，江南大學(xué)與麗珠集團(tuán)蘇州新寶制藥廠合作攻關(guān)，通過發(fā)酵工程和生物制藥工程研制成功了重組人,α-2b,干擾素口鼻腔噴霧劑，解決了干擾素常溫保存穩(wěn)定性問題在疫區(qū)特殊人群捐贈使用，效果顯著誘生的白細(xì)胞或者成纖維細(xì)胞提取核酸,,↓,通過寡,dT-,纖維素柱提取,mRNA pBR322,質(zhì)粒,,↓ ↓,5%-23%,蔗糖密度梯度離心提取,12S- mRNA,內(nèi)切酶切割,,↓,↓,由,mRNA,轉(zhuǎn)錄成,cDNA,切割段位于,β,內(nèi)酰胺基酶基因內(nèi),,↓ 結(jié)果導(dǎo)致內(nèi)酰胺基酶失活，不抗青霉素,雙鏈,cDNA,用末端,Pst-I,酶切割,,↓,再用,DNA,轉(zhuǎn)移酶接上,dT,或者,dG,在,pBR322,質(zhì)粒,DNA,的切割段加上,dA,或者,dC,++++++++++++++++,,退火獲得雜交質(zhì)粒 ↓ 轉(zhuǎn)化大腸桿菌,K-12,擴(kuò)增雜交質(zhì)粒 ↓,篩選能夠抗四環(huán)素、但是對氨芐青霉素敏感的細(xì)菌克隆株,↓,采用雜交翻譯法挑選含有干擾素,cDNA,的克隆 ↓ 將干擾素,cDNA,克隆進(jìn)表達(dá)載體 ↓ 在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá),↓,（進(jìn)入下游工藝）,工程菌構(gòu)建,工程菌的發(fā)酵生產(chǎn),人干擾素,a-2b,的基因工程菌為,SW-IFNa-2b/E.coli—DH5a,。

質(zhì)粒使用,PL,啟動子，含有氨芐青霉素抗性基因種子培養(yǎng)液含,1%,蛋白胨、,0.5%,酵母提取物、,0.5%NaCl, ↓基因工程菌接種到,4,個,1000ml,三角燒瓶之中，每個燒瓶內(nèi)裝有,250ml,種子培養(yǎng)基，,30℃,搖床培養(yǎng),10,小時，作為發(fā)酵罐的種子 ↓用,15L,發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵，裝發(fā)酵培養(yǎng)基,10L,發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下（,1%,蛋白胨、,0.5%,酵母提取物、,0.05%NaCl,、,0.01%NH,4,Cl,、,0.6%Na,2,HPO,4,、,0.001%CaCl,2,、,0.3%KH,2,PO,4,、,0.01%MgSO,4,、,0.4%,葡萄糖、,50mg/ml,氨芐青霉素、少量防泡沫劑pH=6.8, ↓攪拌轉(zhuǎn)速,500r/min,、通氣量為,1,：,1v/v*min,、溶氧量為,50%30℃,發(fā)酵,8,小時（細(xì)菌增殖階段）,42℃,誘導(dǎo),2-3,小時（產(chǎn)物生產(chǎn)階段） ↓,[,監(jiān)控手段：每隔不同時間，取,2,毫升發(fā)酵液，,10000r/min,離心除去上清液，稱量菌體濕重。

],,發(fā)酵物質(zhì),4000r/min,離心,30min,，除去上清液得濕菌，從其中取,100g,懸浮于,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）,500ml,之中，冰浴條件下進(jìn)行超聲破碎↓,4000r/min,離心,30min,，除去上清液沉淀部分用,100ml,抽提液在室溫條件下，進(jìn)行攪拌抽提,2,小時，抽提液組成配方,[8mol/L,尿素、,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）、,0.5mmol/L DTT],↓抽提液,15000r/min,離心,30min,，下層棄去取上清液，用,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）稀釋至尿素濃度,0.5mol/L↓,加入,0.1mmol/L,,DTT,，,4℃,攪拌,15,小時15000r/min,離心,30min,，除去不溶物上清液用截流量,=10000,相對分子質(zhì)量的中空纖維超濾器濃縮↓濃縮液采用,Sephadex G50,層析柱分離，層析柱,2cm*100cm,、先用,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）平衡固定相，上柱之后，用同一緩沖液洗脫分離↓收集人干擾素,a-2b,部分，用,SDS-PAGE,檢查。

再經(jīng),DE-52,柱進(jìn)行純化層析柱,2cm*50cm,、上柱之后，分別采用含有,0.05mol/L,、,0.10mol/L,、,0.15mol/L,的,NaCl,的,20mmol/L,磷酸緩沖液（,pH=7.0,）洗滌↓收集含有收集人干擾素,a-2b,部分分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝[,得率要求：全過程蛋白質(zhì)回收率為,20%-25%,，產(chǎn)品不含雜蛋白質(zhì)、,DNA,、熱原質(zhì)檢測合格],干擾素的制備,（二）乙肝基因工程疫苗,1,、乙肝病毒：,（,1,）二十面體核衣殼，,25,－,27nm,2,）主要結(jié)構(gòu)蛋白為,C,蛋白，又稱核心抗原（,HBcAg,）3,）具有包膜，直徑,35,－,45nm,4,）包膜表面的病毒蛋白，乙肝表面抗原（,HBsAg,）第一代乙肝疫苗，屬血源疫苗，由無癥狀乙型肝炎表面抗原陽性者的血漿制備而得因提取工藝不同，疫苗所含成分也有一定的差別，但均含有,22 nm,小顆粒乙型肝炎表面抗原,但疫苗,的成本高、生產(chǎn)周期長,(65,周,),，還存在傳播艾滋病和肝炎的潛在危險第二代乙肝疫苗，將編碼乙型肝炎表面抗原的基因在哺乳動物細(xì)胞或酵母菌中高效表達(dá)，得到乙肝基因工程疫苗，接種者中約有,10%,不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)；另有,5%,～,15%,接種者屬低應(yīng)答者，低應(yīng)答者不能獲得完全保護(hù)作用。

第三代乙肝疫苗，乙肝病毒包膜的抗原性主要由,S,抗原和前,S1,、前,S2,抗原組成組成，美國,Medeva,制藥公司利用基因重組技術(shù)，在哺乳動物細(xì)胞成功地表達(dá)了包含,S,抗原和前,S1,、前,S2,抗原的第三代重組疫苗，,1998,年用于臨床，能誘導(dǎo)更高的血清陽轉(zhuǎn)率和抗體應(yīng)答反應(yīng),工藝流程,謝謝各位的聆聽,,謝謝觀看,/,歡迎下載,BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH,內(nèi)容總結(jié),基因工程制藥簡介傳統(tǒng)制藥（生化制藥）存在的問題:表皮生長因子（EGF）、EGF衍生物DNA（cDNA第一鏈），再以cDNA或已知其蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再推導(dǎo)出核苷酸序列不致病、不產(chǎn)生內(nèi)毒素絲狀真菌（如曲霉等）等被確認(rèn)是安全菌株，有成熟的發(fā)酵和后處理工藝真核生物和原核生物基因表達(dá)過程示意圖插入型載體: 將外源基因或DNA插入其中常用的信號肽有：堿性磷酸酶信號肽。

缺點：產(chǎn)量不高，信號肽不被切割或不在特定位置上切割提高比生長速率有助于提高質(zhì)粒穩(wěn)定性分離純化目的產(chǎn)物主要依賴于色譜分離技術(shù)↓收集含有收集人干擾素a-2b部分分裝→凍干→成品鑒定→成品包裝另有5%～15%接種者屬低應(yīng)答者，低應(yīng)答者不能獲得完全保護(hù)作用謝謝觀看/歡迎下載,。